蛋白翻譯后修飾的基金申請解析與研究注意點（一）

每年三月初，都是科研界的“高考”倒計時，因為距離國自然基金申請的截止日期已不到半月。縱觀歷年國自然申請情況，蛋白的翻譯后修飾都是申請中重大研究方向之一。2018年國自然統計表明，磷酸化、泛素化、乙酰化等修飾的相關基金項目，總研究資助金額超過2億。

繼上周的腸道微生物研究方案解析后（國自然沖刺：打通菌群多樣性與功能的研究策略），本周我們再抓緊時間為各位老師分享一下國自然中各類修飾的趨勢分析及組學研究的注意事項，以期為各位老師提供幫助。下面我們主要關注三種最常規研究的修飾類型——磷酸化修飾、泛素化修飾和乙酰化修飾。

表現穩定：磷酸化——全能調控之王

磷酸化是修飾中的全能調控之王，其研究最早，且分布廣，修飾量最多。在真核細胞中，約1/3的蛋白隨時都可以被磷酸化，幾乎參與所有的生理、病理過程。因此，磷酸化修飾是所有修飾中最被廣泛認知和重點研究的。

▲ 磷酸化修飾在歷年國自然基金中的申請情況

綜上這些特點，在國自然基金申請中，與磷酸化、激酶相關的研究歷年所獲的資助項目數目均較多、且金額較高。然而，其成熟的研究基礎也使得其每年的基金資助趨勢穩定平緩。2018年的基金統計結果表明，與磷酸化相關的項目數有105個，資助金額4768萬，而與激酶相關的項目數140個，資助金額高達6414.9萬，其中重點項目有2個。因此，磷酸化可以說是修飾的基金申請中一個表現非常穩定的方向。

圖1.國自然基金項目統計-磷酸化

▲ 磷酸化修飾組學研究方案的技術注意點：

● 磷酸化修飾肽段富集方法如何選擇？

由于發生磷酸化修飾的氨基酸有三種--絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸，故根據研究目的的不同，磷酸化修飾肽段的富集方法也不同。目前，比較成熟的磷酸化富集方法主要有：金屬螯合物富集（如TiO2、IMAC富集）和抗體富集兩類。

對于三種氨基酸位點上的修飾均關注的老師來說，金屬螯合物富集是最常用的富集介質。其富集效率較高，通常可以達到90%以上，其中一些商品化的IMAC試劑盒具備很理想的富集穩定性。

而對于重點關注酪氨酸磷酸化修飾變化的老師來說（比如說不少關注腫瘤領域中受體酪氨酸激酶研究的方向），使用TiO2、IMAC則無法滿足要求了，這是由于酪氨酸磷酸化的修飾比例非常低，僅占所有蛋白質磷酸化比例的1%。因此，針對這類分析，往往采用酪氨酸特異性基序的抗體進行富集，才能獲得最佳結果（中科新生命（APT）采用抗體界的金標準--CST的抗體進行酪氨酸磷酸化的富集）。

● 對于后續結果驗證或者靶向檢測的研究目的，如果沒有修飾位點的抗體該怎么辦？

基于質譜的PRM技術是修飾組后續驗證或目標位點靶向檢測的最佳選擇之一。PRM驗證全稱是Parallel Reaction Monitoring,其是基于高分辨率質譜發展的靶向定量技術。由于其只針對特定目標信號進行掃描，可實現目標蛋白、修飾位點的精準定量，其應用目的類似于Western blot。 

PRM已逐漸被業內廣泛認可和關注，Nature、PNAS等高水平研究中已有多篇研究應用。此外，PRM可同時對多個蛋白、修飾位點進行定量，相比傳統的WB,不僅更準確、精細而且更高效。目前，中科新生命已推出磷酸化修飾組+PRM驗證一站式服務，幫助老師快速解決驗證之憂。

● 磷酸化修飾組對樣本量的要求如何？

勢頭正猛：泛素化——蛋白表達調控研究的新角度

泛素化是所有修飾中最為特別的一類修飾，由于發生泛素化修飾的蛋白往往會進一步通過蛋白酶體發生降解（也有一部分會發揮腳手架的作用促進蛋白復合體形成等），因此，蛋白表達水平變化往往是泛素化修飾的重要關注點。泛素化修飾與轉錄、蛋白水平研究同樣重要的，都是調控蛋白表達水平的重要機制之一，但卻往往被研究人員所忽略，其具備相對較高的研究創新性。

▲ 泛素化修飾在歷年國自然基金中的申請情況

從歷年的基金申請情況看，泛素化修飾所申請項目數與金額自2013年后每年均呈現快速增長趨勢，而且2017年-2018年的增長速度為歷年最快。統計結果表明，2018年泛素化研究的資助項目達137個，資助金額共6680.45萬，其中重點項目有5個。