蛋白質內序列分析用肽段的分離與純化實驗

考馬斯亮藍 G 乙酸 甲醇 Achromobacter 胰蛋白酶 I 三氟乙酸 乙腈 2-丙醇

SpeedVac 型旋轉濃縮器 Tween-20 UltrafreeTM MC 濾器 C18 反相 HPLC 柱

材料與設備

考馬斯亮藍 G(0.05% 的乙酸-20% 甲醇溶液）

乙酸 (5% 的 10% 甲醇溶液）

甲醇 (50% 的水溶液和 10% 的水溶液）

SpeedVac 型旋轉濃縮器（Savant Instruments,Inc.)

Achromobacter 胰蛋白酶 I〔賴氨酰內肽酶;50ng/ul 的 0.1mol/LTri-HCl(pH9.0)〕

Tween-20〔0.1% 的 0.1mol/L Tris-HCl(pH9.0) 溶液〕

Ultrafree^TM MC 濾器（22um;Millipore Corp.)

三氟乙酸（TFA;0.1% 的 50% 乙腈溶液)

C18 反相 HPLC 柱 (2.1X250 mm;5um,300A)(VYDAC)

乙腈

2-丙醇

操作程序

1) 用 SDS-PAGE 分離待研究蛋白。

2) 凝膠用 0.05% 考馬斯亮藍 G 染色 15~30 min。

3) 用含 5% 乙酸的 10% 甲醇溶液脫色。

4) 在水中浸泡 10 min。

5) 從凝膠上切下蛋白帶，轉移至微量離心管。切下一段不含蛋白質的凝膠作對照。如必要，可將凝膠切成較小的碎片，使之能容易地沉入微量離心管的底 部。

6) 各管加入 1 ml 50% 甲醇。室溫下孵育 20 min。棄上清。

7) 各管加入1ml 10% 甲醇。室溫下孵育 20 min。棄上清。

8) 凝膠碎片在 SpeedVac 型旋轉濃縮器中干燥 2 min。

9) 各管加 10ul Achromobacter 蛋白酶 I。

10) 各管加最小體積的含 0.1%Tween-20 的 0.1mol/L Tris-HCl(pH9.0)—剛夠淹沒凝膠碎片即可。
注：凝膠碎片會膨脹, 故重要的是要保證它們仍能淹沒在含去垢劑的緩沖液中。

11) 各管 30℃ 孵育 24 小時。

12) 各管在微量離心機中離心，將各管上清轉移至 22-um Ultrafree MC 濾器內。12000r/min 離心 2 min。保留濾液。

13) 加 1 體積含 0.1%TFA 的 50% 乙腈溶液于各管留下的凝膠碎片中--足夠淹沒凝膠碎片。4°C 孵育 30 min。

14) 重復第 12、13 步操作。合并各樣品的濾液。

15) 樣品在 SpeedVac 型旋轉濃縮器中旋轉濃縮至體積小于 100 ml。加適量 HPLC 平衡液，制成供 HPLC 分析用的樣品。

16) 用反相 HPLC C18 柱分離消化液中的肽段。用含 0.09% TFA 的乙腈/2-丙醇 (3:1) 梯度洗脫肽段。于 214mn(對肽鍵）和 295nm(對色氨酸）檢測肽段的 UV 吸收。