利用熒光光譜法研究蛋白質一般有兩種方法。一是測定蛋白質分子的自身熒光(內源熒光)，另一種是當蛋白質本身不能發射熒光時，通過非共價吸附或共價作用向蛋白質分子的特殊部位引入外源熒光(也稱熒光探針)，然后測定外源熒光物質的熒光。
蛋白質的內源熒光
含有芳香族氨基酸(色氨酸(tryptophan ,Trp)、酪氨酸(tyrosine ,Tyr)和苯丙氨酸(phenylalanine ,Phe))殘基的蛋白質在280nm或295nm的激發光的激發下會產生熒光，這種熒光稱為內源性熒光(天然熒光)。Trp、Tyr和Phe由于其側鏈生色基團的不同而有不同的熒光光譜。其熒光峰位波長分別是348、303、282nm，其中Trp的熒光強度最大，而Phe的熒光強度則很低，因此蛋白質的內源熒光主要是由Trp和Tyr殘基形成的。同時在含有Trp和Tyr的蛋白質中，由于其分子發生了從Tyr殘基到Trp殘基的能量轉移, 從而導致Tyr殘基的熒光猝滅和Trp殘基的熒光增加，因而Trp最常被用作內源探針來研究蛋白質的結構。 2. 蛋白質的外源熒光
所謂外源熒光光譜法就是利用小分子熒光化合物與其熒光較弱或不發熒光的物質共價或非共價結合，形成發強熒光的絡合物，然后測定絡合物的熒光。常用測定蛋白質的熒光探針主要有丹磺酰氯、熒光胺、12苯胺基萘282磺酸(12anilinonaphthalene282sulfonate ,ANS)、22對甲苯胺基萘262磺酸(22p2toluidinonathalene262sulfonate ,TNS)、12(N2二甲基胺)2萘252磺酸(12(N2dimethylamino)2naphthalene252sulfonate ,DNS)等。