蛋白質分析技術(AnalyticalTechniquesforProtein)1

第一節 蛋白質分離純化與鑒定的基本原理
一、蛋白質的理化性質
（一）蛋白質的兩性電離

pI：當蛋白質溶液處于某一pH時，蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為0，此時的溶液的pH稱為~。
體內大多數蛋白質：pI≈pH 5.0。在pH 7.4，大多數蛋白質解離成陰離子。少數蛋白質為堿性蛋白質（如魚精蛋白、組蛋白）和酸性蛋白（如胃蛋白酶和絲蛋白等）。

（二）蛋白質的膠體性質
1.蛋白質：生物大分子，MW：1~100萬，大小：1~100nm
2.維持蛋白質膠體穩定因素
蛋白質親水基團→吸收水分→水化膜 →防止蛋白質沉淀析出
蛋白質表面帶有電荷→穩定膠體→防止蛋白質沉淀析出
（三）蛋白質的變性、沉淀和凝固
1.蛋白質變性（denaturation）
2.蛋白質沉淀
（1）疏水測鏈暴露→蛋白質聚集→沉淀（變性）
（2）等電點或去水化膜→蛋白質沉淀（非變性）
3.復性（renaturation）與不可逆變性
（1）renaturation：蛋白質變性程度較輕，去除變性因素后，有些蛋白質仍可恢復或部分恢復其原來的構象和功能，稱為~。
（2）不可逆變性：蛋白質變性后，空間構象被嚴重破壞，不能恢復，稱為~。
4. 蛋白質的凝固作用（protein coagulation）
蛋白質經強酸、強堿作用變性后，仍能溶解于強酸、強堿中，若將pH調節至等電點，則變性蛋白質立即結成絮狀的不溶解物，此絮狀物仍能溶解于強酸、強堿中，這種現象稱為~。
（四）蛋白質的紫外吸收
蛋白質：Tyr和Trp，280nm有最大吸收值，
故A280∝ protein濃度
（五）蛋白質的顯色反應
1.茚三酮反應（ninhydrin reaction）
茚三酮 + 蛋白質 → 藍紫色化合物（在570nm有最大吸收值）。
2.雙縮脲反應（biuret reaction）
CuSO4 + protein or peptide → 紫色或紅色
二、分離純化蛋白質的意義
1.要研究某種蛋白質的結構與功能，生產高活性的蛋白質類激素、酶等，必須separation和purification。
2.在基因工程下游工作中，從“分泌型”的細胞質或從“包涵體”中獲取具有生物活性的、純度好的高蛋白質產品，需要separation和purification

三、蛋白質分離純化的前處理
（一）生物樣品的選擇和處理
1.樣品的選擇：有效成分含量高、來源豐富、保持新鮮、實驗條件恒定、取材工藝簡單、有綜合利用價值等。2.樣品的處理
保存：-10℃冰箱臨時保存，-20℃冰箱短期保存，-70℃冰箱長期保存。
預處理：包括去除脂肪、結締組織等。
耐高溫的成分：烘干長期保存。
有些樣品可先凍干粉，再在冰箱中長期保存。
（二）細胞破碎
機械破碎法：研缽研磨、細菌磨、勻漿器、組織搗碎器、組織分散器。
物理學方法：超聲波粉碎機、壓碎擠壓法、凍融法、滲透壓法。
化學法：有機溶劑或表面活性劑→破壞細胞膜的磷脂結構，增加其通透性→導致整個細胞破碎→提取結合蛋白質和胞內酶。
酶學法：酶→降解細胞壁，例如：溶菌酶→降解肽多糖的β-1,4-糖苷鍵→降解革蘭氏陽性菌。β-葡聚糖酶和蝸牛酶→破壞酵母菌的細胞壁。
（三）抽提（extraction）
1.定義：是指在一定條件下，用適當的溶劑和方法，使有效成分充分溶解到溶劑的過程。
2.抽提液應具備的條件：
對有效成分溶解度大、破壞性小
對雜質溶解度小或不溶解
來源廣泛、價格低廉
操作安全等
3.抽提應控制的因素：
溶劑的 pH值 pH偏離pI，堿性蛋白質選用低pH，酸性蛋白質選用高pI，但pH不能過高或過低，以防蛋白質變性。
溶劑的離子強度和極性：A.鹽溶液抽提時，離子強度較低促進蛋白質的溶解、保護蛋白質活性，離子強度過高則引起蛋白質的salting out。B.有機溶劑抽提脂蛋白、非極性基團較多的蛋白質和酶。
溫度：0~10℃。
抽提液的體積：抽提液︰抽提物=3~5︰1。
添加保護劑：β-巰基乙醇、Cys、GSH→防止或延緩-SH氧化。EDTA→防止-SH和金屬離子產生沉淀。酶的抑制劑：保護蛋白質不被水解。
四、蛋白質的鑒定

SDS-電泳法、等點聚焦電泳法、N-末端Aa殘基分析、HPLC、沉淀分析、擴散分析等。
第二節 蛋白質的鹽析與透析
一、鹽析法與等電點沉淀法
1.鹽析（salting out）
（1）定義：在稀鹽溶液中，蛋白質的溶解度隨鹽濃度的增加而升高這種現象稱為鹽溶（salting in），但當鹽濃度增加到一定量時，其溶解度又逐漸下降，直到某一濃度時便從溶液中沉出，即為鹽析（salting out）。
（2）原理
Salting in：蛋白質吸附某種離子→蛋白質彼此排斥，而蛋白質與水相互作用加強→溶解度提高。
Salting out：大量中性鹽加入→破壞蛋白質分子表面的水活膜，降低水的活度，蛋白質表面的電荷被中和→蛋白質相互聚集而析出。
（3）鹽析中最常用的鹽是：
(NH4)2SO4、Na2SO4、MgSO4，尤其以(NH4)2SO4為最佳。
原因：(NH4)2SO4溶解度大而溫度系數小，分離效果好，能保持蛋白質的天然構象，且價廉可得，這是蛋白質粗提純的一種最常用方法。
（4）分級鹽析的計算方法
A. 添加飽和(NH4)2SO4溶液
V = V0(S2－S1)/(1－S1)
其中V0為原來溶液的體積，單位為ml。
B.加固體(NH4)2SO4
W = B(S2－S1)/(1－AS2)
其中A、B為常數，與溫度有關。W單位： g/L。
C.從有關“生物化學實驗書籍”附錄查詢

2.等電點沉淀法
（1）pH 偏離pI時，蛋白質帶相同符號的凈電荷而互相排斥→蛋白質溶解度大。
（2）pH = pI時，蛋白質的凈電荷為0→蛋白質聚集沉淀
（3）等電點沉淀法的缺點：沉淀不完全。