蛋白質及蛋白質含量測定的幾種方法

蛋白質是生命的物質基礎，沒有蛋白質就沒有生命。蛋白質主要用于維持、生長、妊娠和泌乳等需要。因此蛋白質含量的檢測成為一項日常性且必需性的工作。

蛋白質分子中存在含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，使蛋白質對280nm的光波具有最大吸收值，在一定的范圍內，蛋白質溶液的吸光值與其濃度成正比，可作定量測定。該法操作簡單、快捷，并且測定的樣品可以回收，低濃度鹽類不干擾測定結果，故在蛋白質和酶的生化制備中廣泛被采用。但此方法存在以下缺點：

1.當待測的蛋白質中酪氨酸和色氨酸殘基含量差別較大會產生一定的誤差，故該法適用于測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的樣品。

2.若樣品中含有其他在280nm吸收的物質如核酸等化合物，就會出現較大的干擾。但核酸的吸收高峰在260nm，因此分別測定280nm和260nm兩處的光吸收值，通過計算可以適當的消除核酸對于測定蛋白質濃度的干擾作用。但因為不同的蛋白質和核酸的紫外吸收是不同的，雖經校正，測定結果還存在著一定的誤差。

1976年Bradford建立了用考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合的原理，是一種能夠迅速并且準確的定量蛋白質的方法。染料與蛋白質結合后引起染料最大吸收光的改變，從465nm變為595nm。蛋白質-染料復合物具有高的消光系數，因此大大提高了蛋白質測定的靈敏度(最低檢出量為1μg)。染料與蛋白質的結合是很迅速的過程，大約只需2min，結合物的顏色在1h內是穩定的。一些陽離子(如K+，Na+，Mg2+、)、(NH4)2SO4、乙醇等物質不干擾測定，而大量的去污劑如TritonX-100，SDS等嚴重干擾測定，少量的去污劑可通過用適當的對照而消除。由于染色法簡單迅速，干擾物質少，靈敏度高，現已廣泛用于蛋白質含量的測定。

總氮量的測定——微量凱氏定氮法：當被測定的含氮有機物與濃硫酸共熱消化時，分解出氮、二氧化碳和水，其中氮與硫酸化合成硫酸銨。由于分解反應進行得很慢，故可加入硫酸銅和硫酸鉀或硫酸鈉，其中硫酸銅為催化劑，硫酸鉀或硫酸鈉可提高消化液的沸點，氧化劑(過氧化氫)也能加速反應。

消化終止后，在凱氏定氮儀中加入強堿堿化消化液，使硫酸氨分解放出氨;用水蒸氣蒸餾，將氨蒸入過量的標準無機酸溶液中，全部蒸完之后，用標準的鹽酸溶液滴定收集的氨量，準確測定氨量，從而折算出蛋白質含量。

具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應，蛋白質在堿性溶液中能與Cu2+絡合呈紫紅色，顏色深淺與蛋白質濃度成正比，故可用比色法進行測定，根據標準曲線進行計算可以確定蛋白質濃度。

測定蛋白質含量的經典方法，它是在雙縮脲法的基礎上發展而來的。它操作簡單、迅速、靈敏度高，較雙縮脲法靈敏100倍。Folin-酚法所用的試劑由兩部分組成，試劑A相當于雙縮脲試劑。蛋白質中的肽鍵與試劑A中的堿性硫酸銅反應形成銅-蛋白質復合物。這個復合物可與試劑B中磷鉬酸-磷鎢酸發生氧化還原反應。由于磷鉬酸與磷鎢酸易被酚類化合物還原而呈藍色反應。而蛋白質中的酪氨酸和色氨酸均可發生此呈色反應。顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比。故可用比色法測定蛋白質的含量。

此法易受蛋白質樣品中酚類化合物及檸檬酸的干擾。另外，試劑B中的磷鉬酸-磷鎢酸僅在酸性pH值時穩定，故在將試劑B加入到堿性的銅-蛋白質溶液時，必須立即混合均勻。以確保還原反應能正常發生。此法也適用與酪氨酸和色氨酸的定量測定。