蛋白質的雙向電泳實驗

蛋白質的雙向電泳的第一向為等電聚焦( Isoelect rofocusing ,IEF) , 根據蛋白質的等電點不同進行分離; 第二向為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳( SDS-PAGE ) , 按亞基分子量大小進行分離。經過電荷和分子量兩次分離后, 可以得到蛋白質分子的等電點和分子量信息。蛋白質雙向電泳是將蛋白質等電點和分子量兩種特性結合起來進行蛋白質分離的技術, 因而具有較高的分辨率和靈敏度, 已成為蛋白質特別是復雜體系中的蛋白質檢測和分析的一種強有力的生化手段。

蛋白質

Acr Bis TEMED 原液 過硫酸銨 兩性電解質載體 尿素 NP-40 NaOH H3PO4 SDS Tris-Cl 2-巰基乙醇 SDS-PAGE 甘氨酸 溴酚藍 瓊脂 MgCl2 抗壞血酸 PVP 甘油 2-巰基乙醇 丙酮

研缽 石英砂 燒杯 試管 玻璃棒 量筒 雙向電泳槽

1.  葉片可溶性蛋白質的制備: 取葉片200 mg 加少許石英砂于液氮中研成粉末懸浮于3 ml 可溶性蛋白質抽提液中, 4 ℃放置1 h 以上, 于4 ℃ , 15000 r/ min 條件下離心15 min , 取上清液按1∶4與冷丙酮混合, - 20 ℃ 放置3 h 以上或過夜, 同樣離心取沉淀, 用80% 丙酮洗兩次, 同上離心, 真空干燥, 溶于400 μl(9 . 5 mol/ L 尿素, 5 mmol/ L K₂CO₃ , 1 . 25% SDS, 0 . 5% 2-巰基乙醇, 2 . 2% 兩性電解質pH3 . 5～ 10 , 6% TritonX-100 ) 中, 經離心取上清液上樣。

2.  第一向等電聚焦電泳( IEF)

(1 ) 玻璃管的準備: 取內徑1 . 5～2 mm, 長16 cm 玻璃管用乙醇/ 鹽酸為6/ 4 的溶液浸泡30 min , 再用蒸餾水沖洗, 烘干。灌膠前用封口膜封住管的一端, 并固定。

(2 ) 凝膠的配制與電聚焦: 取尿素2 . 06 g , 加入0 . 75 ml 蒸餾水, 0 . 75 ml 10%的NP-40 , 37 ℃水浴(不能超過37 ℃) , 待尿素充分溶解后加入0 . 5 ml 的凝膠原液和兩性電解質0 . 05 ml ,pH3 . 5～10; 0 . 05 ml , pH4～ 6; 0 . 15 ml , pH6 ～8 , 再加入10 μl 10%l AP 和3 μl TEMED, 混勻后灌膠。在灌好的膠管的頂部覆蓋1 cm 的雙蒸水, 室溫聚合1 h 以上, 待膠聚合好后吸去上層水溶液并加樣30 μl , 再加入20 μl 樣品覆蓋液( 8 mol/ L 尿素,1 . 5%兩性電解質( 0 . 3% pH3 . 5～ 10 , 0 . 3% pH4～ 6 , 0 . 9% pH6～8 ) , 5% NP-40 , 5%2-巰基乙醇) 和50 mmol/ L NaOH 至管口, 待電泳。電極液為: 上槽( 負極) 50 mmol/ L NaOH, 下槽(正極) 25 mmol/ LH₃PO₄ , 在室溫下, 按200 V×15 min , 300 V×20 min , 400 V× 30 min ,500 V× 30 min , 600 V×16 h 的程序進行聚焦。

3.  取膠、pH 梯度的測定及膠條的平衡

聚焦結束后, 取出玻璃管, 吸去兩端的溶液并以雙蒸水清洗, 然后用10 ml 注射器套上200 μl 的tip 頭吸取一些水從進樣的一端輕輕將膠條打出。將要測定的膠條按每段1 cm 分成若干段后, 按順序裝入盛有脫氣的雙蒸水的小瓶中, 放4 ℃ 冰箱過夜,次日用pH 計分別測定各段的pH 值。對要進行第二向電泳SDSPAGE電泳的膠條則必須放入平衡液(60 mmol/ L Tris-Cl pH6 . 8 ,2%SDS, 5%2-巰基乙醇, 10% 甘油, 0 . 05%溴酚藍) 中平衡10～30 min (平衡后的膠條酸端染成淡綠色而堿端染成深藍色)。暫不進行第二向電泳的膠條可放入- 20 ℃保存數日。

4.  第二向SDS-PAGE 電泳

選用DDY-Ⅲ28D 型( 北京六一儀器廠生產) 電泳槽(規格為200 mm×130 mm×1 mm, 雙板) , 分離膠濃度13% , 濃縮膠濃度5% , 分離膠長160 mm, 濃縮膠長40 mm ( 灌至玻璃板上沿) , 灌好濃縮膠后在一端插入單孔梳, 以便加入蛋白質分子量標準品。待膠聚合后, 將第一向平衡好的膠條平放于濃縮膠頂部(避免膠條拉伸) 并用1% 瓊脂糖( 用電極緩沖液配制) 封膠。此時應注意避免膠條與濃縮膠上沿之間產生氣泡( 可先用尖頭滴管將加熱到70 ℃ 的瓊脂糖在濃縮膠上沿薄薄地涂上一層, 立即將平衡好的膠條平放于其上, 再用注射器針頭挑動膠條使其結合完好)。待瓊脂糖凝固后拔出單孔梳, 加入適量用變性膠處理過的marker , 加滿電極緩沖液, 在冰箱中4 ℃ 電泳, 恒壓200 V,至溴酚藍達膠底部為止( 約5 h)。

5.  染色與脫色

電泳結束后, 剝下膠板, 放入染色液( 0 . 05% 考馬斯亮藍R-250 , 50%甲醇, 10% 甲酸40% 水) 中置室溫2 h , 換脫色液(慢脫色液: 7% 乙酸; 快脫色液: 30% 乙醇, 10%乙酸) , 脫色至背景清晰。溫度升高, 染色或脫色速度相對加快。脫色好后的膠最好立即照相, 也可放入7%乙酸于4 ℃冰箱保存以隨時照相。

樣品預處理是雙向電泳的關鍵。等電聚焦電泳的樣品中必須去除鹽離子、色素、酚類和核酸等物質, 還要加入防止蛋白質水解的抑制劑, 所以根據不同樣品需要查閱有關資料進行樣品預處理。聚焦的好壞與兩性電解質的質量也有關系。