蛋白質含量的測定

衡量食品的營養成分時，要測定蛋白質含量，但由于蛋白質組成及其性質的復雜性，在食品分析中，通常用食品的總氮量表示，蛋白質是食品含氮物質的主要形式，每一蛋白質都有其恒定的含氮量，用實驗方法求得某樣品中的含氮量后，通過一定的換算系數。即可計算該樣品的蛋白質含量。

    一般食品蛋白質含氮量為l0％如肉、蛋、豌豆、玉米等，其換算系數為6.25，小麥取5.70，大米5.95、乳制品6.38、大豆5.17，動物膠5.55。

    一、目的與要求：

    掌握微量凱氏法測定蛋白質總氮量的原理及操作技術。包括樣品的消

化，蒸餾吸收及滴定與含氮量的計算。

    二、原理：

    凱氏定氮法：食品經加硫酸消化使蛋白質分解，其中氮素與硫酸化合成硫酸銨。然后加堿蒸餾使氨游離，用硼酸液吸收后，再用鹽酸或硫酸滴定根據鹽酸消耗量，再乘以一定的數值即為蛋白含量，其化學反應式如下。

    (1)  2NH₂(CH₂)₂COOH+13H₂S0₄    (NH₄)2S0₄+6C0₂+12S0₂+  16H₂

    (2)(NH₄)₂SO₄+2NAOH-----2NH₂+2H₂O+NA₂SO₄

    (3)2NH₃+4H₃BO₃----(NH₄)₂B₄O₇+5H₂O

(4)(NH₄)₂B₄0₇+H₂S0₄+5H₂0-(NH₄)₉SO₄+4H₂BO₂

三、試劑與儀器：

1、硫酸鉀

2、硫酸銅   

3、硫酸

4、2％硼酸溶液

5、40％氫氧化鈉溶液

6、混合指示劑：把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚綠溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基紅溶液2毫升混合而成．

    7、0.OINHCL標準溶液或0．01N硫酸標準溶液．

8、凱氏微量定氮儀一套。

9、定氮瓶100m1或50ml一只。

10、三角瓶150ml 3只。

11、量筒50ml、lOml、lOOml。

12、吸量管10ml只。

13、酸式滴定管1支。

14、容量瓶100毫升1只。

15、小漏斗1只。

四、操作方法：

1、  樣品處理：精密稱取0.2-2.0g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸取10-20ml液體樣品（約相當氮30-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸銅，3g硫酸鉀及20毫升硫酸，稍搖勻后于瓶口放一小漏斗，將瓶以45度角斜支于有小孔的石棉網上，小火加熱，待內容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強火力，并保持瓶內液體微沸，至液體呈藍綠色澄清透明后，再繼續加熱0.5小時。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、硫酸銨同一方法做試劑空白試驗。

2、  按圖裝好定氮裝置，于水蒸氣發生器內裝水約2/3處加甲基紅指示劑數滴及數毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數粒玻璃珠以防暴沸，用調壓器控制，加熱煮沸水蒸氣發生瓶內的水。

3、  想接收瓶內加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示劑1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml樣品消化液由小玻璃杯流入反應室，并以10ml水洗滌小燒杯使流入反應室內，塞緊小玻璃杯的棒狀玻璃塞。將10ml 40%氫氧化鈉溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其緩慢流入反應室，立即將玻璃蓋塞緊，并加水于小玻璃杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，開始蒸餾，蒸氣通入反應室使氨通過冷凝管而進入接收瓶內，蒸餾5min。移動接收瓶，使冷凝管下端離開液皿，再蒸餾1min，然后用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N鹽酸標準溶液定至灰色或藍紫色為終點。

同時吸取10.0ml試劑空白消化液按3操作。

計算：

X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) +F*100　

X：樣品中蛋白質的含量，g；

V1：樣品消耗硫酸或鹽酸標準液的體積，ml；

V2：試劑空白消耗硫酸或鹽酸標準溶液的體積，ml；

N：硫酸或鹽酸標準溶液的當量濃度；

0.014：1N硫酸或鹽酸標準溶液1ml相當于氮克數；

m：樣品的質量（體積），g（ml）；

F：氮換算為蛋白質的系數。

   注：

（1）       樣品應是均勻的，固體樣品應預先研細混勻，液體樣品應振搖或攪拌均勻。

（2）       樣品放入定氮瓶內時，不要沾附頸上，萬一沾附可用少量水沖下，以免被檢樣消化不完全，結果偏低。

（3）       消化時如不容易呈透明溶液，可將定氮瓶放冷后，慢慢加入30%過氧化氫2-3ml，促使氧化。

（4）       在整個消化過程中，不要用強火，保持和緩的沸騰，使火力集中在凱氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白質在無硫酸存在的情況下。使氮有損失。

（5）       如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會引起氨的損失，這樣會形成硫酸氫鉀，而不與氨作用，因此當硫酸過多的被消耗或樣品中脂肪含量過高時，要增加硫酸的量。

（6）       加入硫酸鉀的作用為增加溶液的沸點，硫酸銅為催化劑，硫酸銅在蒸餾時作堿性反應的指示劑。

（7）       混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。如果沒有溴甲酚綠，可單獨使用0.1%甲基紅乙醇溶液。

（8）       氨是否完全蒸餾出來，可用PH試紙試餾出液是否為堿性。

（9）       吸收葉也可以用0.01當量的酸代表硼酸，過剩的酸液用0.01N堿液滴定，計算時，A為試劑空白消耗堿液數，B為樣品消耗堿液數，N為堿液濃度，其余均相同。

（10）   以硼酸為氨的吸收液，可省去標定堿液的操作，且硼酸的體積要求并不嚴格，亦可免去用移液管，操作比較簡便。

（11）   向蒸餾瓶中加入濃堿時，往往出現褐色沉淀物，這是由于分解促進堿與加入的硫酸銅反應，生成氫氧化銅，經加熱后又分解生成氧化銅的沉淀。有時銅離子與氨作用，生成深蘭色的結合物[Cu(NH₃)₄]⁺⁺