蛋白質回收實驗

蛋白質

SDS DTT 脫色液 染色液

電泳儀 透析膜

1.  凝膠浸泡在染色液中于室溫緩慢搖動染色15~20 min，然后移至脫色液中于4℃溫和搖動下脫色2~3 h。

2.  切下染色后的凝膠條帶，于4℃水中浸泡2~3 h，期間換幾次水。然后分別將每條膠移入Petri培養皿中，加入10 ml 水覆蓋之，并將它們搗碎成約1 mm³的碎片，再用巴斯德吸管將水吸千。

3.  用一園片狀的Spectrapor 6透析膜將電洗脫儀的洗脫池的底端蓋好，并擰緊帽子
 

圖一、洗脫池

4.  將搗碎的凝膠移入洗脫室的粗大的一端，并以浸泡緩沖液覆蓋，在浸泡液之上，加入一層冼脫液，使之剛沒過水平隧道，排除氣泡。

5.  將洗脫室置于洗脫池之內，加入洗脫液至僅高于各電極槽的排液出口， 將其余的液體加入小混合池中。

6.  連接雙通道蠕動泵，調整流速使溶液能緩饅地從混合池中滴回洗脫池。用彎頭巴斯德吸管吸去洗脫室透析膜下的所有氣泡，小心不要戳穿透析膜。

7.  將凝膠碎片浸泡3~5 h。連接電極，注意將陰極連接于冼脫室有凝膠碎片的一側。50 V 恒壓12~16 h。

8.  關電源，撤去與電極的連接，以透析液代替洗脫罐中的冼脫液。重新連接電極，在80 V 恒壓下12?24、

9.  關電源，撤去與電極的連接，關閉蠕動泵。從罐中取出洗脫室，吸去含洗脫蛋白的收集池中藍色蛋白層上面的緩沖液，以帶平嘴針頭的50 μl 注射器混勻剩余的含蛋白液體。

10.  將蛋白溶液移入一微量離心管中，用50 μl 透析液洗收集池，并合并于蛋白液。

11.  在Speedvac蒸發器中凍干液體，樣品可在-20℃保存。
 

圖二、洗脫儀及洗脫池

12.  樣品用100 μl 水重溶，并以50：50甲醇/丙酮沉淀。-20℃過夜，微量離心沉淀蛋白。

13.  取5%~10%樣品用Laemmli凝膠系統的微型膠分折蛋白冼脫的程度、分子量和回收率，蛋白質可用考馬斯亮藍或銀染法檢測。

14.  將剩余的樣品加樣于瀏序濾膜，用于蛋白質序列分析。