蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（三）

蛋白質純化

RP-HPLC 是一種有效的蛋白質/多肽純化工具。

通過 RP-HPLC 法可以從雜質中分離目標蛋白/多肽，采集到的片段可用于進一步研究，以及借助正交分析技術的分析，甚至可作為治療藥物。

在蛋白質/多肽分析過程中，色譜條件優化的目標是優化分辨率和保留時間。

制備色譜法分離蛋白質/多肽時，色譜條件的開發主要是三個參數的優化（參見圖45）：

• 產量是從色譜法每一步中得到的純化的目標蛋白/多肽含量。高產量可提高純化過程的實用性，并降低成本。

• 純度是從目標產物中去除雜質的程度。純度高有助于從后續分析中獲得更佳的數據或獲得高純度產物。

• 通量用來衡量制備周期中純化的物質量。高通量說明在給定的成本和時間內獲得更多研究或分析用物質，或更多原料藥，用于制藥領域。

由于制備色譜的目的與分析色譜的目的不同，因此色譜條件優化也不同。

圖45. 在蛋白質或多肽的制備純化中，通過尋求產量、純度及通量的最佳平衡實現分離條件的優化。

樣品裝載

在分析色譜中，將小樣品裝載到色譜柱上以確保加樣量不影響分辨率。

如果樣品量過高，則峰會加寬，進而分辨率會下降。

在不發生峰展寬的情況下允許加載到色譜柱的樣品量（“樣品容量”）取決于柱的大小（附錄列表顯示了柱的大小和樣品容量）。

制備色譜法純化蛋白質/多肽時，通常會超出樣品容量，使柱“過載”，從而增加產量和通量（圖46）。

當允許一定的分辨率損失時，加載的樣品量可為樣品容量的10~50倍（附錄，最大實際負載）。

圖46中，盡管由于柱過載使得峰變寬，但峰形相對較好，說明嚴重過載在增加產量的同時還能保持純度，但目標蛋白/多肽的損失不可避免。

由于樣品過載，圖47中峰也同樣加寬。

片段收集、分析和利用

當柱過載時，通常會拋棄起始峰和結尾峰。

圖46中，對紅色區標示的峰的中間區域進行了收集。去掉了峰首和峰尾。

這避免了分離度較差的雜質峰的收集，增加了純度，但降低了產量。

在制備色譜中，對幾種感興趣的峰進行了片段收集，用于雜質分析。  

圖46.在多肽純化示例中，制備分離包括柱的過載加樣，以增加產量。

分辨率降低，為了增加純度必須拋棄峰首和峰尾，但產量稍微有所降低。

基于分析結果，收集了少雜質或無雜質的片段，拋棄了峰首和峰尾附近雜質較多的片段。

收集和拋棄片段的選擇應考慮純度和產量的平衡。

例如，在不損失分辨率的情況下，4.6 x 250 mm的“分析”柱可用于純化少量多肽（最多約200微克）。

但為了增加產量和通量，同樣大小的柱最多可純化10毫克，但會有一定的純度或產量損失。

恰當的收集峰選擇有助于實現純度和產量間的最佳平衡。

在制備色譜中，盡管重點在樣品質量，但樣品體積也可能會很大。

盡管可采用樣品環和注射器，但通過將樣品“泵”至柱上可以注入更多樣品。

將泵的吸入管置于樣品容器內，樣品通過洗脫泵加載至色譜柱。

當有機溶劑濃度低（通常，樣品裝在水相中）且目的蛋白/多肽以有機溶劑梯度洗脫時，可通過這種方式裝入大量樣品。

吸附劑粒徑

分析色譜常用的吸附劑粒徑為5μm，制備色譜常用的吸附劑粒徑更大。

尤其是加樣量超過樣品容量時（柱過載），柱效較分析色譜影響較小。

當柱過載時，大粒徑填充柱同小粒徑填充柱分離蛋白質和多肽的效果一樣。

因此，制備色譜常用10μm或以上粒徑的吸附劑。粒徑分布也往往更寬。

不同于0.5μm或更窄的粒徑分布范圍，制備色譜的粒徑范圍更大，例如10~15μm。

由于制備色譜柱反壓和成本更低，因此更傾向于采用大粒子。