蛋白質定量技術――iTRAQ

摘要：同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）技術是近年來最新開發的一種新的蛋白質組學定量研究技術，具有較好的定量效果、較高的重復性，并可對多達四種不同樣本同時進行定量分析。研究人員采用iTRAQ蛋白質定量技術加速蛋白質的定量研究，當然這門新興的工具仍然需要進一步的完善。
   

僅僅知道蛋白質的身份并不足以對蛋白質給出最終定論，因為蛋白質的濃度對于實現其在細胞中的功能來說極其重要，一種特殊蛋白質在濃度上的變化，就能預示細胞的突變過程。因此，科學家能夠對蛋白質的相對和絕對濃度進行測量，是很重要的事情。過去，科學家通常先進行二維(2D)凝較電泳，切斷條帶，再用質譜方法測量條帶中的蛋白質。可是，這種方法不是很理想：既不是非常敏感，也不是非常精確。

新澤西醫學及牙科大學的蛋白組學研究中心主任Hong Li說：“當我們開始蛋白組學研究時，就采用2D凝膠技術，但得出的信息量卻讓大伙很失望，因為許多蛋白質已經改變了自身的代謝過程，如熱休克蛋白或者是管家蛋白。”   

蛋白組學中的方法一直在不斷提高。基于高度敏感性和精確性的串聯質譜方法，不需要凝膠，就可以獲得相對和絕對定量的蛋白質結果。iTRAQ和iCAT是這些新進展中的兩大主力，但是，新技術也有不盡如人意的地方，需要不斷改進。
 
iTRAQ試劑盒包括四種同量的胺活性試劑，能對蛋白質水解的肽段進行標記，因此采用串聯質譜方法，可以對肽段進行精確的鑒別和定量。美國應用生物系統公司蛋白組學TOF-MS產品主任Dominic Gostick說：“試劑盒包含5步反應所需要的每一種物質。甚至包括胰島素。”   

iTRAQ的操作程序一般如下。將蛋白質裂解為肽段，然后用iTRAQ試劑進行差異標記。再將標記的樣本相混合，這樣就可以對其進行比較。與樣本結合后，通常用MudPIT多維蛋白質鑒定技術進行下一步的操作，用2D液相色譜串聯質譜進行分析。在質譜分析鑒定特殊肽離子片斷結構的基礎上，采用美國應用生物系統公司的軟件包MASCOT和Protein Pilot對每一個肽段進行鑒定。

iTRAQ的發明者Darryl Pappin博士表示，水解之后，每一個蛋白質會產生大量的肽段。用四種iTRAQ試劑對每一個肽段進行標記，每一種都被看作是獨立的測量，所有的測試都是均勻的。但是，有一些蛋白質也許只進行一次肽測定，對哪些肽繼續進行研究最終是由研究人員決定的。

iTRAQ鑒定

iTRAQ定量

有用工具
   

Li認為iTRAQ的試驗過程非常簡單，因為化學標記工作很完善。對于定量工作而言，標記的效果很重要，而且，iTRAQ的定量工作是可重復的。因為如果一個定量方法不能重復，它就沒有意義。   

英國謝菲爾德大學的Phillip Wright博士認為技術的可靠性和可重復性能都很好，iTRAQ的精確性能好于其他的工具，獲得的變異系數在9％的范圍。

為了調查變異系數，研究人員用其他方法對iTRAQ結果進行了驗證。加州大學的Jan Hirsch博士在兩個不同的試驗中，用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)對iTRAQ進行了驗證。他指出，ELISA驗證方法有自己的缺陷，它可能無法檢測到質譜檢測到的所有肽段，或者質譜儀可能將額外的肽段分配到蛋白質中。

iTRAQ比以前的技術更具優勢。Hirsch相信iTRAQ是定量蛋白組學研究中一種非常好的方法，但他認為還需要進一步改善。iCAT和iTRAQ技術的缺陷在于，它們只提供相對的定量。因此，只能對相對豐度進行比較。也就是說，研究人員可以比較兩組不同的樣品，但對一個個體蛋白質的濃度而言，他們只是獲得了一個相對值。標準化的對照可以幫助定量結果，但是常常只提供一個或一對蛋白質的信息。總之，同位素質譜方法能提供有價值的信息，例如可以對經過不同處理后的動物細胞裂解液樣本進行比較。
 
Harbor-UCLA醫學中心的Beerelli Seshi博士說：“因為我們對定量比較感興趣，所以iTRAQ更適合我們，因為它可以同時對四個樣品進行比較。不但可以定量，而且也能進行鑒定。”   

iTRAQ比其他的蛋白質定量方法更敏感。Li說：“采用iTRAQ技術，我們觀察到大量的蛋白質變化情況，而這些變化以前是看不到的。”這是2D凝膠電泳存在的問題之一，因為它的分辨率和低敏感性。觀察低豐度蛋白質中的變化需要高敏感性能。

當然，作為全球通用的蛋白組學方法，它應該是客觀的。Seshi就表示對研究結果沒有傾向性。他采用iTRAQ對體外生長的白血病患者骨髓間質細胞和正常骨髓間質細胞的蛋白質組進行標志，他希望能深入研究“骨髓微環境在白血病的發育過程的影響”這一內容。而且，因為癌癥是一種多基因疾病，一次能同時對多種蛋白質進行研究就顯得很重要。所以，需要強大的蛋白組學方法。

iTRAQ的另外一大優點是，它可以對任何類型的蛋白質進行鑒定，包括高分子量蛋白質，酸性蛋白質和堿性蛋白質，2D凝膠電泳對這些蛋白質都束手無策。而且，2D凝膠電泳無法對膜蛋白那樣的不溶性蛋白質進行分析，但是iTRAQ標記系統和質譜法聯合使用可解決這些問題。

不斷改進
   

蛋白組學研究產生了大量數據。Seshi認為數據太大了，因此需要解決數據挖掘問題，使用合理方法去分析數據。他說：“數據輸出信息并不包括蛋白質的基本信息，如分子量和等電點，為了獲得這些信息，我必須一遍又一遍進行處理，這些參數都可以通過2D凝膠電泳獲得，但是iTRAQ標記和串聯質譜分析獲得的信息要豐富得多。”   

Seshi認為這些豐富度使得數據的復雜度更高，尤其是研究全蛋白組時。在他看來，蛋白組學技術的缺點之一是，他們不適合于全體蛋白組學，因為高豐度蛋白質干涉了低豐度蛋白質的檢測和鑒定。   

Wright表示，將大量的蛋白組學數據相混雜是與鳥槍型處理（如iTRAQ）有關的另一個問題：每次試驗，研究人員都必須鑒別全部的蛋白質組。而2D凝膠電泳方法，運行一次凝膠電泳，就執行一次成像分析，然后只選擇一個蛋白質點進行質譜分析。2D凝膠電泳不能繪制整個蛋白質組，但是能觀察到差異變化。   

iTRAQ不僅用于標記全蛋白質組，也用于亞細胞蛋白質組（如細胞器和膜內部蛋白質）的標記。英國Sainsbury 實驗室的首席科學家Alexandra Jones博士將iTRAQ與磷酸濃縮肽結合使用，設法鑒定Arabidopsis的磷蛋白質組，以及血漿薄膜的蛋白質組信息，她首先用iTRAQ對其進行標記。她表示，濃縮過程非常復雜，涉及到許多步驟，但是一旦提早對蛋白質組進行標記，隨后無論進行多少操作都變得很簡單。

雖然有一些缺陷，但iTRAQ仍然是蛋白組學研究的一個有力工具。繼續對其可用性能進行改善，并且使技術規范化，iTRAQ一定會成為蛋白組學研究中的強大武器。

（譯自《Genomics & Proteomics》）