蛋白質工程技術助力探索離子通道激活機制

　　近日，北京師范大學王友軍課題組及美國德克薩斯州A&M大學Yubin Zhou課題組采用蛋白質工程技術，巧妙地實現了膜蛋白在亞細胞器和質膜之間定位的切換，為研究細胞器膜蛋白的結構和功能提供了更加便捷的手段和新的思路。基于此方法，本文的一作鄭思思、馬國林、何漣“驅使”內質網定位蛋白STIM(Stromal interaction molecule)轉位到質膜上，并進一步鑒定出了STIM蛋白上的一個關鍵位點，實現了STIM 同源蛋白STIM1和STIM2之間功能的“一鍵”（單點突變）互換，從而闡明了STIM1和STIM2不同的分子特性及激活機制。該研究成果“Identification of molecular determinants that govern distinct STIM2 activation dynamics”以長文形式發表于PLOS Biology。

　　鈣庫操縱的鈣內流(Store-operated Ca2+ entry, SOCE) 是動物細胞內普遍存在的一種鈣信號產生和鈣穩態維持機制，SOCE異常與免疫系統、癌癥、心血管疾病及神經退行性疾病等密切相關。SOCE是由內質網上的STIM蛋白和質膜上ORAI 鈣離子通道蛋白所共同介導的，因此揭示STIM激活和調控機制有著非常重要的意義。

　　內質網腔內鈣離子濃度降低所導致的Ca2+從STIM鈣結合功能域（EF-SAM）的解離，是SOCE激活的最初事件。因而對內質網鈣感受器STIM蛋白鈣親和力的準確測定，是闡明其激活分子機制的關鍵。但由于STIM EF-SAM 區域位于難于測量和操縱的內質網腔內，十多年來領域內對STIM1和STIM2的鈣親和力大小一直有爭議。

　　王友軍與Yubin Zhou兩個課題組協同合作，利用蛋白質工程技術將原本內質網定位的STIM蛋白翻轉移位到了質膜上，STIM依然保持了相應Ca2+感應的功能，但是其EF-SAM區從難以操縱的內質網腔內轉移到可以方便而精準調控鈣濃度的細胞外。運用這一原創的質膜定位的STIM，結合兩個課題組之前發展的FRET納米探針原位實時監測STIM激活的技術[1]，研究者得以準確測定STIM蛋白在質膜上時的鈣親和力。結果表明STIM1 和STIM2的鈣親和力都比之前報道的偏低，暗示內質網腔內可能存在未知的調控STIM的細胞因子，從而為后續研究指出新的方向。

　　SOCE激活的關鍵是STIM EF-SAM區在脫去Ca2+后，通過進一步的構象變化將內質網鈣水平降低的信息跨膜傳導至胞漿。本文作者利用原創的納米探針，揭示了STIM蛋白是如何將內質網內的信號經過STIM跨膜區域傳導至胞漿區域、打破胞漿區域的自我抑制, 而使結合ORAI 的區域 (SOAR) 暴露出來[1]。SOAR 區會介導STIM1多聚，進而橋連內質網和質膜。基于上述納米工具，研究者對合作發現的一個新內質網膜蛋白STIMATE進行了、研究，揭示了其輔助STIM1激活的分子機制[2]。SOCE的產生最終需要STIM胞漿部分的SOAR結合，并打開質膜上的Orai1鈣離子通道。

　　雖然之前的工作[3]表明STIM2胞漿區結合并激活Orai1的能力遠較STIM1弱，但相關分子機制并不清楚。本研究運用蛋白質工程技術所合成的一系列SOAR1-SOAR2嵌合體，鑒定出了決定SOAR1 和SOAR2差異性結合（PLOS Biology, 2018）及激活[4] ORAI1的關鍵位點， 從而闡明了SOCE被STIM特異性激活的關鍵分子機制。

　　這一系列工作不僅系統地回答了SOCE調控及激活中的一些關鍵問題，還為治療SOCE相關疾病提供一些新的思路。本研究受自然科學基金面上項目NSFC-31471279和NSFC-31671492、青年千人計劃、北京師范大學自主科研基金資助項目2017STUD20和2017EYT21的資助。

　　1. Ma G., et al., Inside-out Ca(2+) signalling prompted by STIM1 conformational switch. Nat Commun, 2015. 6: p. 7826.

　　2. Jing J., et al., Proteomic mapping of ER-PM junctions identifies STIMATE as a regulator of Ca(2)(+) influx. Nat Cell Biol, 2015. 17(10): p. 1339-47.

　　3. Wang Y., et al., STIM protein coupling in the activation of Orai channels. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009. 106(18): p. 7391-6.

　　4. Wang X., et al., Distinct Orai-coupling domains in STIM1 and STIM2 define the Orai-activating site. Nat Commun, 2014. 5: p. 3183.