蛋白質的微量測序分析實驗

蛋白質

凝膠緩沖液 谷胱甘肽 疏基乙酸 考馬斯亮藍

電泳儀 微量注射器

1.  制備分離膠和積層膠溶液灌制變性微型凝膠。

2.  組裝垂直凝膠電泳裝置。

3.  將80 ml 4×凝膠緩沖液稀釋至320 ml。將200 ml 1×凝膠緩沖 液倒入下層緩沖液槽。

4.  剩余的1×凝膠緩沖液加入還原型谷胱甘肽（干粉）至終濃度1 mmol/l，將它們倒入上層緩沖液貯槽。將凝膠連接于恒壓/恒流電源。

5.  10 mA 下預電泳45 min。

6.  關閉電源，將凝膠放置過夜。

7.  傾出凝膠緩沖液，用紙巾或濾紙吸干加樣孔。

8.  將10×上槽和下槽緩沖液稀釋至1×往下槽倒入200 ml 下槽緩沖液，150 ml上槽緩沖液加入0.1 g 巰基乙酸（鈉鹽）后，倒入上槽。

9.  用微量注射器或凝膠加樣吸頭將溶于凝膠緩沖液的蛋白質樣品加入凝膠的加樣孔。

10.  在10 mA 下電泳至粉紅色的示蹤染料達到凝膠的底部，關閉電源。

11.  用甲醇潤濕2張PVDF膜，然后浸沒在轉移緩沖液中。

12.  拆卸凝膠夾層，輕輕將玻璃板分開。

13.  按下面的次序在小型轉移裝置中組裝轉印夾層：塑料框、海綿、濾紙、凝膠、2張PVDF膜、濾紙、海綿、塑料框。

14.  將轉印夾層插入轉移裝置，最靠近陽極（紅色或正極）的是膜。用轉移緩沖液充滿裝置。

15.  在轉移裝置電極間的電壓降為6 V/cm 的條件下，轉移時間因目標蛋白和凝膠的濃度而異。

16.  拆卸轉印裝置，取出PVDF膜，將它浸沒于含0.1%考馬斯亮藍的50%甲醇中，搖動 5 min。

17.  用含10%乙酸的50%甲醇脫色，搖動至條帶變得清晰可見。

18.  轉印膜移入水中，拍照。

19.  用刀片將目標蛋內的條帶切下（每條帶均用新的刀片），將每一條帶放入微量離心管中，室溫風干（不要加熱），切下的條帶貯存于- 20℃

20.  將切下的條帶放入測序儀的反應室，蛋白面朝向溶劑液流。

21.  在自動化測序儀中測序。