蛋白質抽取實驗

蛋白質在細菌中表現后，以反復的冷凍-解凍方法打破細胞，再用硫酸銨把蛋白質沉淀下來，此步驟可以去除大部份核酸、多醣、脂質等雜物。

儀器用具：恒溫震蕩培養箱37℃；高速冷凍離心機及離心管 （使用20,000 rpm離心陀）使用高速離心機要注意： 離心機及離心陀的溫度要預冷完全，相對位置的兩只離心管要平衡好，離心陀轉速絕對不能超過最高速限；液態氮及冰筒；37℃溫水浴

藥品試劑：轉型菌株pQG11/M15 [pREP] 單一菌落；LB/amp/kan 及IPTG （1 M stock）；Lysis buffer （50 mM Na3PO4·12H2O, pH 7.0; 0.1 M NaCl; 0.1 mM EDTA; 0.2%Triton X-100）

使用前添加成10 mM β-mercaptoethanol, 25 μg/mL PMSF, 40 μg/mL lysozyme.Buffer A-0 （50 mM Na3PO4, pH 7.0） 使用前每1 L 添加70 μL β-mercaptoethanol 成為10 mM 最終濃度。Buffer A-150: Buffer A-0 再加有0.15 M NaCl;硫酸銨 （要烘干并以研砵磨碎）

方法步驟：

1） 挑取培養皿上單一菌落，培養在15 mL 的LB/amp/kan 液體培養基中，以120rpm 轉速震蕩，在37℃下培養過夜。

2） 取上述菌液6 mL加入300 mL新鮮LB/amp/kan培養基中，以120 rpm 37℃培養至A600 = 0.6 后，加入IPTG成為1 mM濃度，繼續以120 rpm在37℃震蕩培養4 h.

3） 將菌液倒入50 mL 離心管 （conical tube） 中離心10 min （5,000 rpm）。

4） 倒去上清，可將菌塊連同離心管置 -20℃冰箱貯存。

5） 取出含菌塊的離心管置碎冰上，待菌塊溶解后，以殘存液體均勻懸濁的。再

加入10 mL lysis buffer 輕輕懸浮的。

6） 將菌液放在液態氮中冷凍1 min,然后在37℃水浴中搖蕩溶解的。如此反復三次，盡量不要產生大量氣泡。將離心管的內容物倒入50 mL 高速離心機的離心管內。

7） 離心20 min （12,000 rpm, 4℃） 取上清共 _____ mL,稱為 粗抽取液 （XT）；預留100 μL 以便日后一起進行分析。此后樣本均得放置碎冰上，以低溫進行實驗。

8） 此上清加入5 mL buffer A-0 混勻后倒入燒杯，置碎冰上放冷，不時攪拌并緩緩加入固體硫酸銨 _____ gm,使成為70%飽和度，加完后再攪拌10 min.

9） 離心20 min （12,000 rpm, 4℃） 后小心倒去上清，取白色沉淀部份。

10） 沉淀加以2 mL buffer A-150 均勻懸濁的，再以桌上型離心機去除不溶物質，（10,000 rpm,5 min），共得 ______ mL,稱為 全蛋白質 （TP）；預留100 μL,連同上述XT 置4℃冷藏。

11） 其余溶液部份準備進行膠體過濾層析，標示清楚后置4℃冷藏。