蛋白質的抽提實驗

轉型菌株pQG11 M15 [pREP] 單一菌落

LB amp kan液體培養基 IPTG Na3PO4·12H2O NaCl EDTA Triton X-100 液氮

恒溫震蕩培養箱 高速冷凍離心機 離心管 冰筒

1.  挑取培養皿上單一菌落，培養在15 mL 的LB/amp/kan 液體培養基中，以120 rpm 轉速震蕩，在37℃下培養過夜。 

2.  取上述菌液6 mL加入300 mL新鮮LB/amp/kan培養基中，以120 rpm 37℃培養至A₆₀₀ = 0.6 后，加入IPTG成為1 mM濃度，繼續以120 rpm在37℃震蕩培養4 h。
 

3.  將菌液倒入50 mL 離心管 （conical tube） 中離心10 min （5 000 rpm）。
 

4.  倒去上清，可將菌塊連同離心管置 -20℃冰箱貯存。
 

5.  取出含菌塊的離心管置碎冰上，待菌塊溶解后，以殘存液體均勻懸濁的。再加入10 mL lysis buffer 輕輕懸浮的。
 

6.  將菌液放在液態氮中冷凍1 min,然后在37℃水浴中搖蕩溶解的。如此反復三次，盡量不要產生大量氣泡。將離心管的內容物倒入50 mL 高速離心機的離心管內。
 

7.  離心20 min （12 000 rpm，4℃） 取上清共 _____ mL，稱為 粗抽取液 （XT）；預留100 μL 以便日后一起進行分析。此后樣本均得放置碎冰上，以低溫進行實驗。
 

8.   此上清加入5 mL buffer A-0 混勻后倒入燒杯，置碎冰上放冷，不時攪拌并緩緩加入固體硫酸銨 _____ gm,使成為70%飽和度，加完后再攪拌10 min。
 

9.  離心20 min （12 000 rpm，4℃） 后小心倒去上清，取白色沉淀部份。
 

10.  沉淀加以2 mL buffer A-150 均勻懸濁的，再以桌上型離心機去除不溶物質，（10 000 rpm，5 min），共得 ______ mL，稱為 全蛋白質 （TP）；預留100 uL,連同上述XT 置4℃冷藏。
 

11.  其余溶液部份準備進行膠體過濾層析，標示清楚后置4℃冷藏。

1. 操作時總是小體積小量的操作，避免污染，并且動作要快。

2. 蛋白酶普遍存在，在提取蛋白質的步驟中，早些抑制，經常抑制。

3. 分裝蛋白溶液，儲存于不同的溫度和不同的緩沖液中，測蛋白活性，找出最適儲存條件。

4. 冷藏，并加入穩定劑。這些穩定劑一般都能充分保持蛋白的生物學活性。

5. 避免酶的反復凍融，如果酶需要凍存，分裝成小管后凍存。

1、儀器用具

恒溫震蕩培養箱37℃；高速冷凍離心機及離心管 （使用20,000 rpm離心陀）使用高速離心機要注意： 離心機及離心陀的溫度要預冷完全，相對位置的兩只離心管要平衡好，離心陀轉速絕對不能超過最高速限；液態氮及冰筒；37℃溫水浴。
 

2、藥品試劑

轉型菌株pQG11/M15 [pREP] 單一菌落；LB/amp/kan 及IPTG （1 M stock）；Lysis buffer （50 mM Na₃PO₄·12H₂O， pH7.0； 0.1 M NaCl；0.1 mM EDTA； 0.2%Triton X-100）使用前添加成10 mM

β-mercaptoethanol，25 ug/mL PMSF，40 ug/mL lysozyme.Buffer A-0 （50 mM Na₃PO₄， pH7.0） 使用前每1 L 添加70 μL β-mercaptoethanol 成為10 mM 最終濃度。Buffer A-150: Buffer A-0 再加有0.15 M NaCl；硫酸銨（要烘干并以研砵磨碎）。

3、蛋白質的儲存：?

（1）蛋白樣品在液氮中速凍，拿出后加入10-20%的甘油，長期儲存。

（2）整個實驗過程中，都要將蛋白樣品置于冰上。

（3）從母管中吸取不同的蛋白時，都要用新鮮的槍頭。

（4）不要將未用的溶液倒回母管。

（5）戴手套操作，避免蛋白交叉污染，或是蛋白酶的污染。

（6）避免劇烈的震蕩，避免溶液中混入蛋白變性劑。

（7）實驗的過程中應避免灰塵進入，灰塵包含60%的肌氨酸。