蛋白質檢測的捷徑

圖1.  蛋白是由氨基酸構成的大分子。

在藥品的質量檢測過程中，常常要對不同產品的總蛋白質含量進行測定。TOC/TNb總有機碳（總氮）分析作為一種熱催化分解技術，由于只需要很短的檢測時間，并省略了一系列檢驗樣品的制備工作等因素，具有重要的應用前景。

在醫藥工業領域，質量管理人員經常要對原料、半成品和成品的蛋白質含量進行檢測。對于這種檢測，目前已經有許多可以選用的檢測方法了。僅在歐洲藥典（ph. Eur. 2.5.33）中，就規定了6種基于不同反應原理和檢測原理的蛋白質含量檢測方法。這些方法可以粗略劃分為：酚試劑法、考馬斯亮藍法、蛋白質定量試劑盒BCA法和雙縮脲法。它們都是以特定氨基酸殘基不同的染色反應為基礎，通過測定可見光譜范圍內特定波長的吸收率來確定蛋白質含量的方法。另外，標準中還規定了一種紫外線吸收法、一種熒光分析法和兩種通過檢測氮含量來推斷的方法。

蛋白質是氨基酸構成的大分子物質，是動物和植物細胞的基本組織。由100多個氨基酸構成的氨基酸鏈通常也稱之為“肽”或者“縮氨酸”。許多蛋白質，例如病毒和抗體（免疫球蛋白），實際是蛋白質復合物，是將一個個蛋白質經氫鍵、離子鍵或者二硫鍵相互連接起來的。

所有這些連接都有一個共同的特點：它們都含有大量的氮原子。用總氮分析可測得其總量通常涉及兩種方法，一種是利用硫酸進行測定的基耶達爾法；另一種是DIN EN 12260標準介紹的在氧氣中高溫燃燒的催化檢測法。

圖2.  Multi N/C 2011 S型TOC/TNb分析儀。

總氮檢測方法

在測定含有蛋白質的溶液或者懸浮液的含氮量時，由于可供檢驗的樣本量很少，常常需要采用直接在樣本中注入并完成檢測的方法。當注射量為50~100ml時，樣本量少于100ml的樣本足夠完成多次檢驗測定了。

按照過去15年來DIN EN 12260標準規定的水基樣本總氮（TNb）檢測方法，在樣本制備時，現代化的催化器應保證燃燒溫度高于700℃。經過這種所謂的熱催化分解之后，將從樣本中催化出大部分氮化合物和一小部分高氧化的氮化合物。在加入運載氣流之后，產生的NO（一氧化氮）被運送到化學熒光分析儀（CLD）。其中，NO與CLD中的O3開始發生化學反應，產生能量活躍的NO2（二氧化氮）。與常規化學反應一樣，性質活躍的NO2在光電倍增管射線的照射下回到NO2的基態，反應如下：

這種方法適合于對任何含氮化合物的總氮數據進行檢測，而不是對分子氮（N2）的含量進行檢測。也就是說：在這種蛋白質檢測方法中，無機氮化合物以及有機的非蛋白原的氮化合物的存在能夠成為干擾。但這種總氮檢測方法卻因省略了所有的樣本制備，只需通過3~5min的檢測時間即可完成。

利用Analytik Jena公司研發生產的Multi N/C 2100 S型蛋白質含量分析儀，可以高效、自動地在各種液體樣本中測定蛋白質的含量；同時還可以完成TOC、TIC和TC等參數的檢測。

Multi N/C 2100 S是一臺在液體樣本中直接注入并檢測TOC/TNb總碳（總氮）的檢測儀，帶有高溫燃燒的催化裝置和石英玻璃燒管。Multi N/C 2100 S使用100、250或者500μl等不同規格的直接注入器，結合使用2ml或者8ml的自動進樣器架，能夠完成各種不同的蛋白質含量檢測任務。即便是含有顆粒的懸浮液，也可以使用大內徑小管以及標準的樣本搖勻、磁力采樣等方法進行精確的蛋白質含量檢測。由于采用直接注入的方法，因此該分析檢測儀的檢測精度與所使用的注入器小管直徑無關，能夠得到準確性很高的、良好可重復性的檢測結果。在目前使用鉑催化劑、利用合成氣體為載體的情況下，通常的催化燃燒溫度為800℃。

圖3.  某免疫疫苗的TN總氮檢測曲線。

該分析儀的測量范圍在0.1~200μg/ml總氮之間，檢測的靈敏性可與最靈敏的BCA法（0.1~200μg/ml蛋白質）相比較。

在這種蛋白質測定方法中，最具有決定性的一點是測定方法的標定以及將樣本中檢測到的總氮換算成蛋白質含量總量。一般來講，建議用多種方法進行標定，也就是說：在含蛋白質溶液的TN總氮測定時，也采用標準的蛋白質標定方法。這樣就會得出銨基-硝酸鹽混合標準標定方法與標準規定之間的差異。

在利用這種總氮檢測方法對免疫疫苗的檢測分析中，所使用的牛血清白蛋白的指定含氮量為15.87％，純度大于98％。該牛血清白蛋白標準樣本中氮含量換算的因子為6.30。

在有關技術資料、文獻中，常用的氮濃度換算因子一般為6.25：蛋白質含量[mg/ml]＝氮因子（6.25）×TN含量[mg/ml]。

在所進行的一系列試驗中，除了將牛血清白蛋白溶液作為檢驗標準以外，還有水質高免血清1-3，IgG濃度8.3mg/ml的兔血清作為參考標準（參見圖4）。它們按照蛋白質換算因子6.25換算后的氮含量為1.328mg/ml。標準溶液的稀釋與檢驗標準無關。

圖4.  利用BSA標準對2.5~20mg/L的TNb總氮樣本進行多點標定。

在附表中匯總了各種不同免疫疫苗的檢測結果。這些檢測結果是對200μl樣本5倍直接注入后檢測的結果。

小結

利用TNb總氮分析儀可以按照DIN EN 12260標準對蛋白質含量進行分析檢測。利用這一方法，可以取代工作量大而重復性差的、且易受干擾的蛋白質檢測分析方法，實現快速、可靠和自動化的蛋白質分析檢測。

這種分析檢測方法能獲得寬的線性檢測范圍、高靈敏度和選擇性，并省略了樣本制備的準備工作，從而也明顯地降低了檢測結果的人為干擾因素。

這種方法是歐洲藥典中規定的一種檢測分析方法，相比較而言也是非常簡單的一種方法。原本一些可能產生的干擾性因素，例如有機氮或者非蛋白質的無機氮化合物等會給許多蛋白質分析檢測方法帶來干擾，如今也都因為蛋白質的沉淀和分離而不再成為影響因素了。

利用總有機碳（總氮）分析確定蛋白質含量

總有機碳（總氮）TOC/TNb分析法是利用在氧中高溫燃燒催化的方法檢測樣本中總氮含量，從而測定蛋白質含量的方法。這種方法是歐洲藥典中規定的方法，能夠得到良好可重復性的檢測結果，并且易于實現自動化檢測。它的優勢在于：

直接在樣本中進行操作，無需樣本制備。不足100ml的樣本足以完成多次測定；

檢測時間短，每個樣本的檢測時間為3~5min；

在較寬的線性檢測范圍內可準確地、選擇性地進行檢測。