蛋白質檢測概述

蛋白提取

蛋白樣品提取是蛋白定量和分析的基礎。天然蛋白質分子結構、化學性能各異，選擇適當的細胞裂解液制備蛋白樣品至關重要。選擇細胞裂解液時，除了要考慮蛋白產量，還要考慮所選擇的一抗的是否能識別線性的抗原表位。一些含有十二烷基硫酸鈉（SDS）和強離子去污劑（如脫氧膽酸鈉等）的蛋白質裂解液能夠從組織或細胞中提取出大量的蛋白質，適用于PAGE，Western blot等檢測；但由于這類裂解液易使蛋白變性，因而不適于免疫共沉淀（Co-IP）等實驗。當使用某些只能識別非變性的抗原表位的抗體時，應該選擇不含去垢劑或含有較溫和的非離子去污劑（如NP-40，Triton X-100等）的裂解液，而不能使用含有SDS和強離子去垢劑的蛋白質裂解液。

蛋白濃度測定

確定蛋白樣品濃度對許多實驗都是至關重要的。通常大多數蛋白樣品的濃度可以通過比色測定法定量。根據一些特殊化學試劑與蛋白質結合發生顏色變化的原理，使用分光光度計或酶標儀檢測特定波長下的吸光值，通過與蛋白標準品進行比較，可以換算出樣品中的蛋白含量。Bradford蛋白質定量試劑（Cat. No. E161-01）具有靈敏度高、簡便快速、價格低廉的特點；BCA蛋白質定量試劑（Cat. No. E162-01）可提供更高的靈敏度和準確性，而且不受去垢劑的影響，更適宜微量蛋白的測定。

蛋白質電泳和Western blot

蛋白質電泳是分離、鑒定蛋白質分子量和濃度的重要方法，尤其是聚丙烯酰胺凝膠電泳（Po l yac r y lamide Ge l Electrophoresis，PAGE）。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺可聚合形成具有分子篩效應的網狀結構聚合物，作為電泳時的固相支持物。進行非變性PAGE（Native PAGE）時，蛋白質在電泳過程中保持完整的狀態，并依三種因素分開：分子量大小、形狀和所帶電荷。變性PAGE（SDS-PAGE）中，添加了作為變性劑和助溶劑的陰離子去垢劑SDS。SDS一方面可以打開蛋白質分子內和分子間的氫鍵，破壞蛋白質的二級和三級結構，消除蛋白質間形狀上的差異；另一方面可以和解聚后的氨基酸側鏈按比例結合，使得蛋白質-SDS復合物所帶的負電荷大大超過蛋白質本身的電荷量，消除了蛋白質間的電荷差異。因此，在SDS-PAGE中，蛋白質在電場下的遷移速率只和其分子量大小相關。

不同濃度Tris-Glycine凝膠的zui佳線性分離范圍
 

免疫印跡法（Western blot）是鑒定蛋白質和多肽，以及檢測蛋白表達水平常用的手段。該技術通常是將經過PAGE分離的蛋白質或多肽分子轉移到固相載體（PVDF膜或硝酸纖維素膜）上，通過目標蛋白的特異性抗體（一抗）進行免疫反應，再與酶標記的第二抗體（二抗）反應，經過底物顯色或發光，從而檢測到特異性目的蛋白。