蛋白質濃度分析實驗

標準蛋白質

BSA

干燥試管

一、標準 Bradford 分析

1. 準備 3 份標準品（用水稀釋），BSA 濃度為 0.2~0.9 mg/ml，IgG 濃度為 0.2~1.5 mg/ml。一般設定 4 個或 5 個濃度比較合適。如果樣品中蛋白質濃度可能超過分析范圍，那么應用樣品緩沖液相應稀釋。分析的樣品至少為雙份。

標準蛋白質：使用純化蛋白質作為相對標準；BSA 或 lgG 試劑盒能夠買到（如從 Bio-Rad )。用去離子水制備濃度為 2 mg/ml。

Bio-Rad 蛋白質分析緩沖液或染色劑（包括乙醇、磷酸和考馬斯亮藍 G250 )：使用濃縮的或者將 1 份稀釋到 4 份去離子水中并通過 Whatman #1 濾紙過濾（在 4℃ 可保存 2 周）。

2. 分別吸取樣品和標準品各 100 μl 置入干凈的干燥試管中（10 ml 或更大）。加 5.0 ml 稀釋過的染色劑到各試管中。搖勻后于室溫放置至少 5 分鐘。

準備一個空白對照，其中加 100 μl 用以制備裂解液或稀釋（裂解緩沖液中）標準品的緩沖液。

在混勻后 1 小時內（最好在混勻后 10 分鐘）在 595 nm 處讀取吸收值，如果可能， 可用一次性的塑料杯。

3. 將每個標準濃度得到的 A₅₉₅ 吸收值加以平均，減去空白的吸收值，然后繪制吸收曲線再對樣品的吸收值進行平均，減去空白對照值，從吸收曲線上推算出樣品的濃度。

二、Bradford 微量分析

1. 按上述步驟 1 制備標準品，標準蛋白使用范圍為 BSA 1.2~10.0 μg/ml，IgG 為 1.2~25.0 μg/ml。

2. 吸取 800 μl 樣品或標準物質置干凈的干燥試管中。每個試管加 200 μl 未稀釋的染色劑，如上所述方法搖勻后罝于室溫下。

3. 混勻后 1 小時內讀取 595 nm 處的吸收值按上述步驟 3 估算蛋白質濃度。