蛋白質鑒定更加準確

圖1.  蛋白混合酶解產物的LC-MS/MS 離子色譜圖，反相分離時間為90min。

質譜技術在蛋白質組學研究中扮演著非常重要的角色。高分辨率、高質量精度的質譜儀能夠降低實驗中誤差，增加實驗數據的準確性。

蛋白質鑒定是蛋白質組學研究的核心所在，而質譜技術在蛋白質組學中扮演著非常重要的角色。

shotgun策略是一種鑒定蛋白質混合物的方法，它越來越廣泛地應用于蛋白質組學的研究中，而在shotgun技術的應用過程中，質譜的性能是非常重要的一個組成部分，高分辨率、高質量精度的質譜儀能夠降低實驗中誤差，增加實驗數據的準確性。

本實驗就是運用shotgun技術分析一些已知蛋白質肽段的混合物，以此來對Thermo公司的LTQ-Orbitrap質譜儀的分辨率、質量精度等相關性能進行測試，從而對LTQ-Orbitrap質譜儀用于肽段的鑒定進行評價。

材料與方法

材料

19 種標準蛋白的混合物，包括BSA、 Cytochrome C、Thyroglobulin、Myoglobin、Transferrin 等來自豬、馬等動物的蛋白。

蛋白酶解

將這19種蛋白按照標準的實驗步驟進行酶解。簡述如下，將蛋白混合物用6M 鹽酸胍進行變性，然后用DTT 將其二硫鍵進行還原，再加入IAA進行烷基化反應；然后將蛋白質混合物置于100mM 碳酸氫銨溶液（pH8.5）中，最后加人適量胰蛋白酶于37℃酶解20hr。

LC-MS/MS 分析

蛋白質酶解混合物反相分離在一臺Surveyor LC上進行，分析柱為75μm x 150mm的C18反相柱，流動相分別為含0.1%FA的水和乙腈溶液，流速為300nl/min，反相梯度為50min內乙睛與水的比例從2%升高到40%。

圖2.  A是在Orbitrap上的洗脫時間為42.97min 時的Full MS掃描圖譜，顯示了在此時間點的肽段混合物。Orbitrap的掃描分辨率設置為60000 (m/z=400)；B-D是三個標記不同的m/z的放大，顯示了其峰型、分辨率和電荷數。

肽段的鑒定在LTQ-Orbitrap質譜儀上進行，質譜分析模式為一個在Orbitrap中的Full MS 掃描后加上三個在Full MS掃描中最高強度的離子在LTQ中進行的MS2掃描和一個在Full MS 掃描中最高強度的離子在Orbitrap中的MS2掃描。其中Orbitrap中的MS2掃描分辨率設置為60000(m/z=400)。其中Orbitrap中的Full MS掃描和三個LTQ 進行的MS2掃描是同步進行，大約花費的時間為ls，而Orbitrap中MS2掃描時間大約為0.3s，整個5次掃描花費的時間為1.3s。另外，在質譜分析的過程中使用了動態排除模式，每個m/z只做兩次MS2掃描。

數據庫搜索

將19種標準蛋白的Swiss-Prot數據庫中的蛋白序列提取出來，然后將19種蛋白序列反轉得到19種相反的氨基酸序列，最后與原始序列一塊形成一個含38個氨基酸序列的fasta文件的正反數據庫。

圖3.  A是Orbitrap在反相洗脫時間為46.81min 時檢測到的Full MS 質譜圖中m / z為677.80597的放大圖，經MS / MS分析該序列為NYELLCGDNTR。B是該母離子在LTQ 中的MS /MS圖，C是該母離子在Orbitrap中MS2掃描分辨率設置為7500 ( m/z= 400）的MS / MS 圖。

SEQUEST進行數據庫搜索時mass tolerance設置為0.01Da，所有殘基不加可變修飾，半胱氨酸殘基加上固定修飾為57.02146Da。最后通過XCorr和ΔCn使結果錯誤率控制在1%以下。

結果和討論

整個實驗過程中，LTQ-Orbitrap Full MS掃描設置的分辨率為60000 (m/z=400) , Mass range 為400~1800。圖1顯示了整個分離過程中質譜檢測的色譜圖。圖2A顯示了反相洗脫時間為第42.97min時檢測到的Full MS質譜圖。圖2B顯示低m/z的單同位素峰452.55859的分辨率為62601。圖2C顯示中等m /z的單同位素峰678.33392的分辨率為51501。圖2D顯示高m/z的單同位素峰1031.41724 的分辨率為42301。很明顯，質量分辨率隨著m/z增加而降低，但是高m/z的分辨率還是非常令人滿意的。

表1.  蛋白酶解后用質譜鑒定到的部分肽段

表1顯示了部分肽段的鑒定結果，結果顯示鑒定到的肽段的質量精度非常高，檢測到的質量與理論質量相差非常小，最低差異為0.000lDa，最高的差異為0.0032Da ,這個結果說明了LTQ-Orbitrap質量掃描非常準確，也證明我們鑒定結果的可靠性。

我們還對LTQ 做的MS/MS結果與Orbitrap做的MS/MS結果進行了比較。圖3A顯示了序列為NYELLCGDNTR,其母離子m/z單同位素為677.80597 的Full MS質譜圖，其分辨率為51701，將其換算成一價離子分子量為1354.6065Da，而該序列的理論一價離子分子量為1354.6056Da，檢測到的質量與理論質量只相差0.0009Da或0.6644ppm。圖3B和圖3C是NYELLCGDNTR肽段分別在LTQ中和Orbitrap中的MS/MS圖，很明顯這兩次MS2掃描中高豐度的離子碎片是完全一樣的，鑒定結果中圖3B和圖3C都找到了理論的20個b/y離子中的17個，而且這兩次MS/ MS找到的17個b/y離子完全一樣。這個結果說明了離子在從LTQ 往Orbitrap的傳輸過程中，其離子的相對豐度是不變的。而Orbitrap 中的MS/ MS的離子碎片的質量精度和分辨率都非常好，這對于de novo 測序應該非常有幫助。

結論

很明顯，使用LTQ-Orbitrap分析肽段混合物可以得到高質量的肽段數據。Orbitrap的分辨率能夠達到40000~60000，而且檢測到的離子質量與離子的理論質量相差非常小。LTQ -Orbitrap的這些特點有助于提高結果數據的準確度，降低數據中的假陽性。

LTQ-Orbitrap具有掃描速度快、分辨率高和質量精度高的優點，這些優點非常適合于bottom -up方式的蛋白質學研究。LTQ 和Orbitrap具有相似度較高的MS/MS圖，但是Orbitrap得到的MS/MS碎片離子的分辨率更高，質量精度更準確，這將極大地提高序列分析中的準確度。