血基因組DNA提取實驗

抗凝全血

血基因組DNA 試劑盒

96孔深孔板 96圓孔板 96孔DNA制備板 96圓孔硅膠片 BF-400膜

一、試劑盒組成、貯存、穩定性
 

1.  說明書，耗材：96孔深孔板（1.6 ml），96圓孔板，96孔DNA制備板，96圓孔硅膠片，BF-400膜。
 

2.  Proteinase K：凍干的蛋白酶K 可室溫貯存6 個月，長時間保存請置于4℃；溶解后，在2-8℃可貯存2 個月，長時間保存請勿置于室溫中。
 

3.  Buffer PK ：蛋白酶K 溶解液，室溫密閉貯存。
 

4.  Buffer BL ：細胞裂解液，室溫密閉貯存。
 

5.  Buffer W1B concentrate ：洗滌液。使用前，根據瓶上數量加入乙醇，混合均勻，室溫密閉貯存。可用100%乙醇或95%乙醇。
 

6.  Buffer W2 concentrate ：去鹽液。使用前，根據瓶上數量加入乙醇，混合均勻，室溫密閉貯存。可用100%乙醇或95%乙醇。
 

7.  10xBuffer W2（12x96 試劑盒）：用于配制Buffer W2 。
 

8.  Eluent B：7.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，0.3 mM EDTA ，室溫密閉貯存。
 

二、實驗準備
 

1.  第一次使用時，在Buffer W2 concentrate 和Buffer W1B concentrate 中按試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇。
 

2.  Buffer W2（12x96 試劑盒）配制：在提供的500 ml 空瓶中加入15 ml 10xBuffer W2，135 ml 去離子水和350 ml 乙醇，可用100%無水乙醇或95%乙醇。
 

3. 根據瓶上標簽將蛋白酶K 溶解于Buffer PK 中，請勿旋渦振蕩。
 

4. 準備70℃溫浴。
 

5. 使用前檢查Buffer BL 是否有沉淀析出，若出現沉淀，請于70℃溫浴加熱至沉淀完全溶解后再使用。
 

三、操作步驟
 

1.  向96 圓孔板的每孔中加入20 ul 蛋白酶K。
 

2.  加200 ul 抗凝全血到96 圓孔板中。
 

* 若全血樣品體積少于200 ul，用PBS 補充到200 ul。

* 若樣品為鳥類血，樣品用量須低于10 ul。

* 若需得到RNA-free 的基因組DNA，在步驟3 加入Buffer BL 前加入DNase-free 的RNase A(20 mg/ ml) 。
 

3.  加200 ul Buffer BL ，注意不要打濕每孔的邊緣，用96 圓孔硅膠片密封各孔。
 

4.  用力混合30 s。
 

5. 3000 rpm 簡短離心使96 圓孔硅膠片上的溶液到96圓孔板內。啟動離心機，當速度達到3000rpm后即停止。
 

6. 在培養箱或烘箱中70℃溫浴至少10 min。
 

7.  3 000 rpm 簡短離心使96 圓孔硅膠片上的溶液到96圓孔板內。啟動離心機，當速度達到3 000rpm后即停止。
 

8. 取下96 圓孔硅膠片，每孔加入200 ul 乙醇（96-100%）。
 

9.  用96 圓孔硅膠片密封各孔，用力混勻混合15 s。3 000 rpm 簡短離心使96 圓孔硅膠片上的溶液到圓孔板內。啟動離心機，當速度達到3 000 rpm 后即停止。
 

10.  將96 孔DNA 板放到一潔凈的96 孔1.6 ml 深孔板。取下圓孔板上的96 圓孔硅膠片，將每孔中的溶液轉移至96 孔DNA 板 中，6 000 rpm 離心4 min。
 

11.  丟棄96 孔1.6 ml 深孔板的濾液，將96 孔DNA 板放回到96 孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入500 ul Buffer W1B，用一新的BF-400 膜密封96 孔DNA 板，6 000 rpm 離心4 min。
 

* 確認在Buffer W1B concentrate 中已按試劑瓶上的指定體積加入無水乙醇。
 

12.  丟棄96 孔1.6 ml 深孔板的濾液，將96 孔DNA 板放回到96 孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入850 ul Buffer W2，用另一新 的BF-400膜密封96孔DNA板，6 000 rpm 離心4 min。
 

* 確認在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的指定體積加入無水乙醇。
 

13.  棄濾液，將96孔DNA板放回到96孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入400 ul Buffer W2， 用另一新的BF-400 膜密封96 孔DNA 板，6 000 rpm 離心4 min。
 

14.  將96孔DNA板放在一潔凈的96 孔1.6 ml 深孔板上，用BF-400膜密封96孔DNA板，6 000 rpm離心15 min。
 

15.  將96孔DNA板放在另一潔凈的96 孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入100-200 ul Eluent B 或去離子水，室溫靜置2 min，用另一新的BF-400膜密封96 孔DNA板，6 000 rpm 離心4min洗脫得到DNA。
 

 1.  Buffer BL 和Buffer W1B 含刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套和眼鏡，避免沾染皮膚、眼睛和衣服，謹防吸入口鼻。若沾染皮膚、眼睛時，要立即用大量清水和生理鹽水沖洗，必要時尋求醫療咨詢。