血液中的寶藏：細胞外RNA

　　血液是唯一與所有器官都有接觸的組織，攜帶著有關機體的大量寶貴信息。在理論上，檢測血液攜帶的 DNA、RNA、囊泡和細胞殘骸可以幫助人們診斷和監控各種疾病。產前基因篩查是血液檢測的一個重要應用，不過其他循環生物學指標正在受到越來越多地關注，比如甲基化、RNA、微囊泡和外泌體。為了幫助大家更好的分析甲基化、分離囊泡、提取RNA、存儲樣本和分析數據，The Scientist雜志最近與多位專家學者探討了檢測不同血液生物學指標的策略，貢獻出了相應的注意事項和實驗技巧。

　　上接：血液中的寶藏：外泌體microRNA

　　研究者：加州大學圣地亞哥分校副教授Louise Laurent，美國轉化基因組研究所副教授Kendall Van Keuren-Jensen

　　研究項目：鑒定胎盤功能障礙（Laurent）和大腦損傷（Keuren-Jensen）的循環miRNA指標

　　研究背景：近年來，人們在血漿或血清樣本中成功檢測到了疾病相關的RNA（exRNA）。這些細胞外RNA可以成為非侵入性的疾病診斷指標，這是RNA檢測最有前景的發展方向之一。在多種細胞受到破壞的疾病中（比如大腦損傷），循環miRNA是非常重要的生物學指標。研究這些miRNA的團隊很多，可供選擇的實驗方案也不少，不過研究者們還沒有就此達成一致。Laurent和Keuren-Jensen都是美國NIH細胞外RNA交流協會的成員，他們正在努力推動循環miRNA檢測的標準化，提升細胞外RNA研究的可重復性。

　　胎盤囊泡：在妊娠期間，胎盤會將包含RNA的囊泡釋放到母體血液中。Laurent希望從中鑒定胎盤疾病的miRNA指標，比如子癇前期和宮內生長受限。她和同事正在優化自己開發的方法，從外泌體和微囊泡提取miRNA并分析相關數據。初步研究結果顯示，母體血液中的外泌體和微囊泡都可以分離出妊娠特異性miRNA。妊娠后期的miRNA指標與胎盤組織的關系尤為密切。

　　大腦撞擊：Van Keuren-Jensen團隊將監控撞擊數據的感應器裝在橄欖球運動員的頭盔中，并在橄欖球賽季中收集運動員的血液、尿液和唾液樣本。他們對這些樣本進行RNA測序，尋找與撞擊數據有關的生物學指標。研究人員使用了一系列商業化試劑盒，并且對細胞外RNA收集方法進行了比較。“使用不同的試劑盒或分離方法會造成很大的差異，”Van Keuren-Jensen說。“現在還很難斷言哪種試劑盒最好。”

　　注意事項：有些測序試劑盒使用帶“粘性”末端的短片段DNA來結合要擴增的目標分子。這些末端（被稱為接頭）可能給實驗結果帶來很大的變數。有些試劑盒產生的接頭二聚體比較少，但測序偏好比較大。有些試劑盒提供的接頭更隨機化，可能與某些miRNA結合得更好。“這些因素會使結果產生較大差異，導致難以重復的結果，”Van Keuren-Jensen說。

　　實驗技巧：Laurent指出，減少樣本批次、盡量由同一個人操作有助于降低結果的差異性。使用內參（比如不受疾病影響的一種RNA）是提高結果可重復性得另一條途徑。在沒有一個通用標準的情況下，“設立內參可以幫你去除產量或批次差異帶來的許多影響，”Laurent說。Van Keuren-Jensen建議大家在論文中分享自己所用的試劑盒和分離方法，因為這些信息對實驗結果的重復很有幫助。

　　監控exRNA只需要采集血樣，不像腫瘤活檢那么有風險，成本也比較低。不過從血漿或血清中分離exRNA仍有一定的挑戰性，一方面是因為exRNA豐度低，另一方面是因為血液中的污染物會抑制PCR。商品化的試劑盒能簡化和加速exRNA提取過程，已成為循環exRNA研究不可缺少的工具。然而很少有人橫向評估這些試劑盒的提取效率如何，是否能去除血漿中的污染物，是否會偏向特定的RNA。而這類評估對于結果解釋和實驗之間的比較都很關鍵。

　　于是，美國愛因斯坦醫學院的研究人員評估了市場上7種常用的exRNA提取試劑盒，分別來自貝克曼?庫爾特、Life Technologies、Exiqon、Zymo、QIAGEN公司。他們具體評估了合成RNA的總體回收率、不同大小的合成RNA的回收能力、exRNA產量和純度，以及純化后的擴增效率。研究結果發表在《BioTechniques》雜志上。（更多詳細信息參見：細胞外RNA提取試劑盒究竟哪家強？）

　　早期非小細胞肺癌（NSCLC）是無癥狀的，并且很難檢測到，因為目前沒有可用的NSCLC血液測試。最近，在Cell子刊《EBioMedicine》發表的一項研究中，南京大學生命科學學院的張辰宇教授和南京大學附屬金陵醫院的張春妮教授帶領的研究小組，確定了一組（五個）血清microRNA（miRNA），作為NSCLC診斷的潛在生物標志物。