血紅蛋白與核黃素的凝膠柱色譜分離

原理
凝膠滲透色譜就是按照溶質分子的大小不同而進行分離的一種色譜技術，當溶質分子大小不同的樣品溶液通過凝膠柱時，由于凝膠顆粒內部的網絡結構具有分子篩作用，分子大小不同的溶質就會受到不同的阻滯作用，本實驗血紅蛋白分子量大，不易滲入網絡，被排阻在凝膠顆粒之外，因而所受到阻滯作用小，先流出色譜床。核黃素分子量小，能滲透到網絡的內部，洗脫流程長，因此所受到的阻滯作用大，后流出色譜床，這樣就可以達到分級分離的目的。
本實驗采用Sephadex G-25凝膠柱，分離血紅蛋白和核黃素的混合溶液，并測出洗脫曲線。
操作
1．凝膠處理：
(1)溶漲與浮選：將凝膠放入過量的水中浸泡6小時(沸水浴中為2小時)。浸泡后攪動凝膠再靜置，待凝膠沉積后，傾去上層細粒懸液，如此反復多次。
(2)平衡：將浸泡后的凝膠，用十倍量的洗脫液處理，約1小時，攪拌后繼續去除上層細浮懸液。
2．裝柱
將色譜柱垂裝好，自柱底端出口的膠皮管內用重力通入溶液以除去柱管內和砂芯底部的氣泡，待氣泡排出后，使溶液在底端留至3~5cm高即行關閉，將處理好的凝膠在燒杯內用2倍的溶液攪調成懸浮液，自柱頂部沿管內壁緩緩加入柱中，待底部凝膠沉積至1~2cm時，打開底端出口管，隨之繼續添加凝膠懸液直至床體積沉積至25cm高度為止。(操作中注意防止產生氣泡與節痕)。
3．平衡：柱裝好后，使色譜床穩定5~10分鐘，然后接上恒流泵，打開出口用2倍于床體積的洗脫液平衡，使色譜床穩定。流速為0.5ml/分。

注意：在洗脫時，要將恒流泵至色譜柱的連接管內氣泡全部排除，以免影響流速，調節流速可在靠近柱的底部加一調節閥，另外在調節中務必防止流速過大以及色譜床液體流干。此外如果需要溫度平衡則同時在色譜柱夾套內通入恒溫冷卻水。
4．色譜床校正：為了取得良好的色譜效果，因此在色譜前需要對所裝的色譜柱進行檢查，檢查的方法如下：
首先用肉眼觀察色譜床是否均勻，有沒有“紋路”和氣泡，床表面是不平整，然后再用蘭葡聚糖2000進行色譜行為的檢查，在色譜柱內加入1ml(2mg/ml)蘭葡聚糖2000，然后用洗脫液進行洗脫(流速同前)，在色譜中當移動的指示劑色帶狹窄，均一，則說明裝柱良好，檢查后再經洗脫平衡再重復步驟“3”即可使用。
5．加樣與洗脫：打開平衡好的色譜柱底部出口，使柱內溶液流至床表面時關閉，將吸有0.5ml樣品的加樣滴管在床表面上1mm處沿管內壁輕輕轉動加進樣品，加完后，再打開底端出口使樣品流至床表面。用少量洗脫液同樣小心清洗表面1~2次，然后將洗脫液在柱內約加至2cm高，接上恒流泵并調好流速即開始洗脫(注意在加樣和洗脫過程中防止沖壞床表面)。

6．收集與測定：收集時可用自動分部收集器，每管接洗脫液3ml，或以手工操作分管收集15管，收集后用72型(或721型)分光光度計在451nm波長處以脫液為空白，對每管收集液進行光吸收測定，測定后以收集管數(或ml)為橫坐標，吸光度為縱坐標對應作圖。
［注］：市售凝膠如需徹底處理，可在溶漲后再用0.5N NaOH-0.5N NaCl溶液在室溫中浸泡半小時，但注意必須避免在酸或堿中加熱。另外，用過的凝膠柱如需再生時，可用0.1N
NaOH-0.5N NaCl，洗滌以去掉堵住凝膠孔的雜質，然后用蒸餾水洗至中性備用。一般使用
幾次后就需要再生。
儀器
1．色譜柱：高40cm，內徑10mm
2．恒流泵
3．自動分部收集器
4．刻度吸管、試管
5．722型分光光度計

試劑
1．葡聚糖凝膠，Sephadex G-25
2．血紅蛋白及核黃素
3．洗脫液：0.05mol/L pH7.3磷酸緩沖液