血細胞分離技術（一）

采血  

（一）材料與試劑

1．抗凝劑
（1）肝素：肝素是含硫酸基的粘多糖，常用其鈉鹽或鉀鹽，它能阻止凝血酶原轉化為凝血酶，進而抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白，從而阻止血液凝固。常用的肝素溶液濃度為1 000U/ml，市售肝素多為100U~126U／mg。
（2）乙二胺四乙酸（EDTA）：是一種螯合劑。用生理鹽水配制成4％的溶液備用。
（3）阿氏液（Alsever液），配方如下：
 枸櫞酸鈉（Na3C6H5O7·5H2O）      0.80g
 枸櫞酸                            0.0325g
 葡萄糖                            2.05g
 氯化鈉                            0.42g
 H2O        加至                  100.00ml
混勻溶解后，114.3℃高壓蒸汽滅菌10min備用。
阿氏液中既含有枸櫞酸鈉抗凝劑，又含有細胞生存的營養，所以它既可做抗凝劑，又可做血細胞的保存液。
2．針頭  根據不同動物和采血部位，采用不同型號的針頭，用前必須滅菌或消毒。
3．采血容器  注射器或三角瓶等。
4．采血動物。

（二）操作方法
1．采血法  各種動物采血方法不一。馬、牛、羊等大動物一般從頸靜脈采血，豬從頸靜脈、前腔靜脈或耳靜脈采血，家禽由翼下靜脈或心臟采血，兔由心臟或耳靜脈采血，犬由頸靜脈或四肢靜脈采血，豚鼠由心臟采血，小白鼠則可斷尾或剪斷腋下血管或剪斷眼球采血。
2．抗凝  采集血液最關鍵的問題是抗凝，采用什么方法進行抗凝，則根據實驗的要求和條件而定。最常用的方法如下：
（1）肝素抗凝：采血時，使每ml血液含15U~20U肝素即可。計算采集的血液量，按1 000U/ml的量加入肝素，直接放入采血容器中，采血時，邊采血邊輕輕搖動，使抗凝劑和血液混勻。對于采少量的血液或小動物采血，可直接用注射器抽取一定量的肝素液，再采血直接抗凝。
（2）EDTA抗凝：采血前，用滅菌生理鹽水將EDTA配制成4％溶液，然后按預采血液的量，以每ml血液加入1mg~2mg的EDTA的液體量于采血容器內。采血，并不斷搖動采血容器，使之混勻。
（3）玻璃珠法：預先將適量的玻璃珠（根據采血量多少而定）清洗后，裝入采血容器中，滅菌后備用。采血過程中，邊采邊搖采血瓶，以使小玻璃珠在血液中滾動，以機械地除去纖維蛋白，使血液不能凝固。本法雖較麻煩，但對淋巴細胞的活性影響最小，且可減少血小板的混雜。
（4）阿氏液采血：以阿氏液和采血量以1︰1比例采集血液，邊采邊輕輕搖動采血瓶，使之混勻。用阿氏液采血，除了抗凝外，多用于紅細胞的保存。一般在4℃條件下，阿氏液中保存的紅細胞2周其活性和特性不變。

紅細胞的分離技術

（一）材料與試劑

1．肝素等抗凝劑
2．3％明膠液  取明膠3g，溶于0.9％滅菌鹽水100ml中，114.3℃滅菌10min，冷卻后4℃冰箱保存。臨用時，37℃預熱10min。
3．阿氏液

（二）操作方法
1．采血抗凝，即為紅細胞。由于紅細胞與白細胞的比例相差懸殊，一般白細胞混雜在其中，忽略不計。
2．根據紅細胞的用途，可做進一步的處理。如計算紅細胞，可直接稀釋計數。如需做補體結合反應，或其它溶紅細胞反應，則需將紅細胞進行充分的清洗，以除去附著在紅細胞膜表面的血漿。一般用等滲的稀釋液連續清洗，2 000r/min離心10min，重復3~4次。
3．如需儲藏備用，則以阿氏液做抗凝劑采血，混勻后置4℃冰箱保存，可保存2周，其活性尚可。

淋巴細胞的分離技術
 
（一）材料與試劑
1．淋巴細胞分層液有兩種：
（1）聚蔗糖—泛影葡胺液：聚蔗糖（polysucrose solution）,商品名Ficoll，分子量400 000，多配制成40±1％（W/V）水溶液，也有干粉出售。應用時，用蒸餾水配制9％溶液。泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici)，商品名Vrografin，結構式為3，5—二乙酰氨基2，4，6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇。含量為60％或75％，每安瓶為20ml裝，常用于人的臟器造影。應用時，取60％泛影葡胺原液20ml，加雙蒸餾水15.38ml，即為33.9％泛影葡胺。

1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制：
9％聚蔗糖液                 24份
33.9％泛影葡胺液            10份
混合即可。必要時，可測比重。需要備用，可用G5漏斗過濾除菌或114.3℃高壓滅菌15min，4℃保存。一般可保存3個月。
如要配制不同比例的分層液，可按下列公式計算：
式中dm為分層液的比重，d1和d2分別為9％聚蔗糖和33.9％泛影葡胺的比重，V1和V2分別為它們的體積。如需配制1.077比重的聚蔗糖—泛影葡胺的分層液，則9％的聚蔗糖和33.9％的泛影葡胺的比例應為100︰46.3。
（2）泛影葡胺—右旋糖酐（dextran）液
 34％泛影葡胺液               10份
 60％右旋糖酐液               12.5份
混合，即為比重1.07～1.09的分層液。分裝于棕色瓶中，4℃冰箱保存備用。

2． 3％的明膠液  稱取明膠3g，溶于0.9％的滅菌生理鹽水，終體積100ml，114.3℃高壓滅菌10min，冷卻后4℃冰箱保存，臨用時37℃預熱10min。

3．Hank’s液。