血細胞的分離方法1

血細胞由紅細胞,白細胞,血小板等組成.實驗中常用白細胞來做研究,如炎癥滲出,細胞遷移,識別等都涉及到白細胞.白細胞又分為:粒細胞,淋巴細胞,單核細胞等.它們具有不同的功能.實驗中常需要分離血細胞方能進行。

這里主要論述人外周白細胞的分離，主要是中性粒細胞（Neutrophil），淋巴細胞（Lymphocyte），單核細胞（Monocyte）的分離。其它骨髓，脾淋巴細胞等分離可參，不同種屬間請注意分離液的選擇。

細胞分離中需要注意的幾個問題

1.如果您要做細胞培養，記住實驗中所用的試劑（分離液，洗滌液等）、器械等都要是無菌消毒的，并注意實驗中的無菌操作。

2. 離心轉速單位及時間：目前國外的文獻報道基本上用g為單位，注意g和轉速（rpm）的換算。

3.離心溫度：有的要求室溫，有的要求4攝氏度。實驗的操作要求盡可能熟練，連貫。

4.在用Ficoll分離單個核細胞（PBMC）時，通常含有少量的紅細胞，對于一般的實驗影響不大，如果實驗要求較高，可采取裂解液（有的需要無菌），并注意裂解時間控制，以免影響單個核細胞的活性。

5. 在用Percoll配不連續梯度時（一般用高滲NaCl），注意各成份體積的準確性，否則密度與預期的不一樣，影響分離效果。

6.用全血離心效果比全血稀釋后再離心效果差，稀釋一般等體積稀釋一倍。

7.分離液與樣本的體積比：一般應小于1：2（即一般為1體積分離液，2體積樣本，不宜超過2體積，小于2體積均可）

8.洗滌液的成分：不同文獻報道不一，有的使用PBS，有的為Hank’s，KRP等，可自己選定。主要是離子濃度及成份的不同，有的含有 Mg2+,Ca2+。

9. 細胞活性：0.2%臺盼藍染色3－5分鐘，鏡下觀察計數死亡細胞（藍染）。

中性粒細胞分離的方法

1、標準方法：Ficoll-泛影鈉（Ficoll-Hypaque）密度梯度及紅細胞裂解法

1）取一50ml聚乙烯管，無菌采集人外周靜脈血，加4.4ml3.8%或5%的檸檬酸鹽液定容至40ml。上述全血300gX20min，離心，室溫。

2）吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制備無血小板血漿（platelet-poor Plasma, PPP）。

3）余下的沉降全血加入5ml　6%Dextran (分子量500,000，用無菌生理鹽水配制)，并用生理鹽水（0.9%）調節最終體積至50ml，輕輕、徹底混勻。室溫沉降30min。

4）吸出富含白細胞的上層液，275gX6min。

5）沉淀的細胞用8mlPPP-生理鹽水（1：4）重懸，并移到15ml離心管中。

6）懸液細胞上面加入3mlFicoll-Hypaque（密度1.077），750gX5min，室溫。

7）吸取富含中性粒細胞和紅細胞層，用0.155M　NH4Cl重懸細胞，使紅細胞裂解，然后中性粒細胞用含0.25%BSA Hanks平衡液（HBSA，無鈣）洗2次，最終用HBSA（含鈣）重懸。

8）用此法可得95%以上的中性粒細胞。
2、不連續的密度梯度血漿－Percoll離心法

1）先制備Percoll儲存液：Percoll原液（100%）:0.9%NaCl的體積比為9：1。

2）取一50ml聚乙烯管，無菌采集人外周靜脈血，加4.4ml3.8%或5%的檸檬酸鹽液定容至40ml。上述全血300gX20min，離心，室溫。

3）吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制備無血小板血漿（platelet-poor Plasma, PPP）。

4）余下的沉降全血加入5ml　6%Dextran (分子量500,000，用無菌生理鹽水配制)，并用生理鹽水（0.9%）調節最終體積至50ml，輕輕、徹底混勻。室溫沉降30min。

5）吸出富含白細胞的上層液，275gX6min。

6）沉淀的細胞用2~3mlPPP重懸

7）在一15ml離心管中依次加入2ml42%、2ml51%Percoll(均為用PPP新鮮配制)、2~3ml細胞懸液，275gX10min.

8）單個核細胞及部分血小板位于血漿與42%Percoll液之間，中性粒細胞位于42%Percoll與51%Percoll之間。血小板可通過 25%Percoll離心5min去除，也可在原密度梯度中加入第三個25%Percoll一起離心去除。

9）中性粒細胞層用PPP液冼1次，再用含糖的Krebs-Ringer磷酸緩沖液（KRPD，PH7.23）洗1次。

10）用這種方法可得80%中性粒細胞，純度在95%以上。

3、“無LPS”方法（LPS-Free method)

1）已有用變形細胞（如白細胞）裂解的方法表明，容器及溶液的不含LPS，也就是說，LPS的含量小于 0.1ng/ml。

2) 無菌采集靜脈血，用10%檸檬酸鈉抗凝。

3）抗凝血中加入6%的Dextran(mol wt 70,000)，比例為3：1（vol/vol,blood/dextran），室溫，1小時。

4) 收集白細胞的血漿，離心，去上清。

5）紅細胞用低滲的0.2%NaCl裂解15秒（此步也可用0.155M　NH4Cl　15秒代替）

6）離心前立即加入10ml 1.6%NaCl（含糖(dextrose) 2mg/ml）

7) 離心后用KRPD洗2次。

8）此法得到中性細胞數與方法2類似，但純度只有80-85%，余下為淋巴細胞及單核細胞。

8）此法得到中性細胞數與方法2類似，但純度只有80-85%，余下為淋巴細胞及單核細胞