血細胞的分離方法2

4、從3中所獲得的中性粒細胞進行純化

1）因為方法3只能獲得80－85%純度的中性粒細胞，可以把方法2與方法3聯合對中性粒細胞進行純化。

2）收集從方法3 dextran沉降所得到的富含白細胞的血漿，275g*6min，離心。

3）管底沉淀用2ml PPP重懸

4）在一15ml離心管中依次加入2ml42%、2ml51%Percoll(均為用PPP新鮮配制)、2~3ml細胞懸液，275gX10min。

5）分別用PPP及KRPD各洗1次

6）用這種方法所得的中性粒細胞純度高達99%以上，并且中間不需要紅細胞裂解的步驟。

krebs-Ringer phosphate（KRPD緩沖液）的配制：
130 mM NaCl, 5mM KCl, 1.27 mM MgSO4, 0.95 mM CaCl2, 5 mM glucose, 10 mMNaH2PO4/Na2HPO4, pH 7.4

配制方法：

A液：NaCl　7.5985g ; KCl 0.3727g ; CaCl2 0.1054g，glucose-H2O 0.9495g, 加ddH2O 100ml溶解；

B液：NaH2PO4-2H2O 0.2964g Na2HPO4-12H2O 2.9011g，加100mlddH20溶解后加入MgSO4-7H2O　0.3130g，充分溶解。

將A、B混合，用ddH20將體積調節至990ml左右，用1M NaOH或1M HCl調節pH至7.2~7.4，定容至1000ml。

外周血中嗜堿性粒細胞分離方法（聚蔗糖－泛影葡胺法）

1）取肝素抗凝血3ml

2）加等量PH7.4HEPES-ACM緩沖液（HEPES 25ml含CaCl2 1ml,NaCl 130ml,KCL5mmol,MgCl2 1ml,用NaOH調節至PH7.4)混勻后，疊加在3ml的密度為1.085的分離液上，2000r/min離心20分鐘；

3）吸取中間層的白細胞，用Hanks液洗2次，每次1000r/min離心10分鐘，棄上清；

4）調整細胞濃度，涂片染色計數，嗜堿性粒細胞濃度大于90％。

外周血中嗜堿性粒細胞分離方法（Percoll密度梯度離心分離法）

1、Pcrcoll混懸液的配制：Percoll 90ml,HBSS 9ml, HEPES(0.25mol/l)1ml(PH 7.3),HCL(1mol/l)0.4ml 調節至PH7.4

2、制備Percoll密度梯度管

3、加分層液的順序：底層先加4ml 1.088g/mlPercoll液，第二層加4Ml1.079g/mlPercoll液，嘴上曾加3ml 1.070g/ml的Percoll液，制成3個密度梯度管，用于分離堿性粒細胞。 4、將新鮮的抗凝血（用0.1mol/lEDTA PH 7.7抗凝）按等體積加于Percoll密度梯度分層液上，室溫下1200r/min離心25分鐘。

5、將每一細胞層分別吸出各放于1支試管內，加無Ca,Mg離子的Hanks液在4度下洗滌3次，每次 1200r/min,離心10分鐘棄去上清。

6、將分別得到的各層細胞涂片，固定后用Wright-Giemsa染液染色，在顯微鏡下檢查嗜堿性粒細胞（大多數在中間層，但不同個體嗜堿性粒細胞的密度不同，因此可能會出現在其他細胞層），嗜堿性粒細胞染成紫紅色。

外周淋巴血細胞分離（ficoll密度梯度離心法）

1.肝素抗凝靜脈血，用Hank’s液約等體積或2倍體積稀釋

2.用滴管輕輕加到 FICOLL上，注意：動作要輕，緩，血液層和FICOLL層的界面要清晰。FICOLL和稀釋后的血的體積比甚至可以達到1：4

3.離心:溫度為25 度，2000rpm 20分鐘

4.離心后吸取中間的白色云霧狀狹窄帶（注意不要吸到FICOLL層），置于另一試管中

5.加入盡可能多的 Hank’s液洗滌吸取的細胞，1600rpm 8分鐘，洗2次

6.細胞計數，將細胞以一定的濃度種到培養板中，加入營養液培養。

7.分離的時候特別要注意溫度，FICOLL和Hank’s液以及營養液使用之前要37度溫一下；血液層和FICOLL層的界面清晰；FICOLL離心溫度為25度，不能使用離心機上的brake功能。

外周淋巴細胞分離方法

1.5ml 抗凝血緩慢沿壁加到5ml淋巴細胞分離液上。（我用的是15ml離心管。有一次用50ml離心管，同樣是5ml血對5ml分離液，就沒分開，可能是淋巴細胞分離液的高度不夠。如果血開始保存在4度，記得要回溫到室溫才開始添加）

2.室溫 500g離心20分鐘（好像離心時間不能過長，否則對細胞不好）

3.取中間云霧狀白色雜帶，置于另一50ml離心管中。

4.25ml PBS洗滌（如果混有紅細胞，在之前可以用紅細胞裂解液，37度裂解5分鐘。）

5.1,000 rmp 離心10分鐘

6.重復4和5

7.2ml 10% 胎牛血清+RPMI1640重懸。

8.計數

9.調整至10ml后培養。
如果要凍存，用凍存液（10%DMSO+20% 胎牛血清+RPMI1640）4℃,1-2h→-20℃,0.5h（這一步時間不能過長，否則冰晶過大，對細胞有害）→-80℃過夜 ，然后液氮中保存。如果，有那種能一度一度降溫的盒子，凍存就好辦了。直接按照它的說明做就行了。

單核細胞分離方法

將用等體積生理鹽水稀釋的抗凝血，加入塑料離心管中的Ficoll Hypaque分離液表面，以450 g離心25min收集單個核細胞，用10 小牛血清的RPMI一1640培養液懸浮細胞，置于6x 6 cm 玻璃培養皿中，在5 ％CO2 、37℃ 下孵育2 h，收集貼壁的單核細胞。用0.2乳白蛋白的RPMI-1 640培養液懸浮單核細胞，Wright染色計數單核細胞>95％，調整細胞密度為4×10／ml。將細胞懸液加入24孔培養板中，在5 ％CO2，37℃ 下培養24 h，離心收集上清液，凍存于一70℃ 冰箱中備用。細胞培養前后臺盼藍染色法測定細胞存活率。

單個血小板的分離和保存

無菌操作下穿刺肘中靜脈取血，取用2% EDTA (1∶9)抗凝新鮮血,經100 ×g離心10 min, 獲得富血小板血漿( PRP) , 經含1 g/L 牛血清白蛋白(BSA ) 的Hepes Tyrodes洗脫液平衡的Sepharose 2B凝膠柱分離純化后得血小板沉淀,然后用TEN緩沖液(0. 05mol/L Tris2HCl, 0. 15 mol/L NaCl, 6 mmol/L ED2TA, pH 7. 4)洗滌3次,最后血小板懸浮于TEN緩沖液中,調血小板密度為1 ×109 /ml,加入終濃度為1 mmol/L 苯甲基磺酰氟( PMSF)和1%的Triton X2100,置于4 ℃冰箱過夜,次日10 000 ×g 離心15min,取上清液為血小板破碎液,分裝, - 20 ℃保存備用。細胞培養前后用臺盼藍染色法測定細胞存活率 。