衣藻的遺傳技術(轉化)實驗

細胞

EcoRI 酶

SGII 培養基

1. 500 ml 燒瓶中裝 250 ml SGII 培養基，在通氣和恒定光照條件下，培養細胞至 5X10⁶ /ml 密度。

2. 用 EcoRI 酶切質粒。

3. 去細胞壁，低速離心濃縮細胞，在 SGII-NO₃ 培養基重懸細胞為 10⁹ 個/ml。

4. 將細胞放入滅菌燒瓶中，剛好蓋上瓶底，在亮光下輕搖 4 個小時。

5. 轉化時，將細胞稀釋到 1.7X10⁸ 個/ml，取 0.3 ml 加入裝有 0.3 g 玻璃珠的 15 ml 帶塑料帽的圓錐形離心試管中。

6. 加入滅菌 PEG 溶液，終濃度為 5%。

7. 立即加入 1 μg 線性化的 pMN24 DNA，用旋轉混合儀最高速度旋轉混合 45 秒。

8. 立即加入 10 ml SGII-NO₃ 培養基稀釋交配混合液，將細胞倒入一干凈的 15 ml 試管中，用桌面醫用離心機沉淀離心。

9. 留 0.3 ml 培養基，重懸細胞，涂布在 SGII-NO₃ 培養基的 1% 瓊脂平板上。

10. 平板放在恒定的光照下孵育 5~8 天。

11. 通常轉化后孵育 8 天，克隆可用肉眼觀察到時，用滅菌牙簽將單個克隆轉到多孔皿上含少量 SGII-NO₃ 培養基的單個孔中過夜培養。

12. 在選擇培養基平板上劃線，分離轉化的純克隆。