表面等離子共振分子互作BIACORE的原理

首先先了解幾個術語和定義：

表面等離子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）

一、消逝波

當光從光密介質入射到光疏介質，入射角增加到某一角度，使折射角達到90°時，折射光將完全消失，而只剩下反射光，這種現象叫做全反射。

當以波動光學的角度來研究全反射時，人們發現當入射光到達界面時并不是直接產生反射光，而是先透過光疏介質約一個波長的深度，再沿界面流動約半個波長再返回光密介質。則透過光疏介質的波被稱為消逝波。

如下圖所示。

全反射時如圖中所示沿X軸方向振幅衰減的一個波，即入射光波在反射面不立即消失，而是投射進入光疏介質一定深度，且振幅在垂直方向呈指數衰減，這種電磁波叫消逝波。

二、等離子波

把金屬表面的價電子看成是均勻正電荷背景下運動的電子氣體，其中正、負帶電粒子數目幾乎相等，這實際上也是一種等離子體。當金屬受電磁干擾時，金屬內部的電子密度分布會變得不均勻。因為庫侖力的存在，會將部分電子吸引到正電荷過剩的區域，被吸引的電子由于獲得動量，故不會在引力與斥力的平衡位置停下而向前運動一段距離，之后電子間存在的斥力會迫使已經聚集起來的電子再次離開該區域。由此會形成一種整個電子系統的集體震蕩，而庫侖力的存在使得這種集體震蕩反復進行，進而形成的震蕩稱等離子震蕩，并以波的形式表現，稱為等離子波。

三、SPR光學原理

光在棱鏡與金屬膜表面上發生全反射現象時，會形成消逝波進入到光疏介質中，而在介質中又存在一定的等離子波。當兩波相遇時可能會發生共振。當消逝波與表面等離子波發生共振時，檢測到的反射光強會大幅度地減弱。能量從光子轉移到表面等離子，入射光的大部分能量被表面等離子波吸收，使反射光的能量急劇減少。

可以從反射光強響應曲線看到一個最小的尖峰，此時對應的入射光波長為共振波長，使反射光完全消失的入射角就是SPR角。SPR角隨金膜表面折射率變化而變化，而折射率的變化又與金膜表面結合的分子質量成正比。因此可以通過對生物反應過程中SPR角的動態變化獲取分子之間相互作用的特異信號。

SPR生物傳感器的光源為偏振光（polarized light），傳感芯片（sensor chip）表面鍍有一層金膜，實驗時，先將一種生物分子（ligand）固定在金膜表面，然后將與之相互作用的分子（analyte）溶于溶液（或混合液）流過芯片表面。SPR檢測器能跟蹤溶液中的分子與芯片表面的分子結合、解離整個過程的變化，不同角度的反射光的光強被記錄后得到角度-光強曲線圖，每條曲線的波谷即為該曲線的共振角，共振角對應的角度為共振信號（resonance signal），時間與對應共振信號的曲線即為SPR傳感圖（sensorgram）。

表面等離子共振生物分子相互作用分析儀（BIACORE）的原理

當一束光線通過棱鏡射向金屬表面，在金屬發生全反射現象時，會在金屬膜中產生消逝波，消逝波與表面等離子波發生共振時，檢測到的反射光強會大幅度地減弱。此時對應的入射光波長為共振波長，對應的入射角為共振角，即SPR角。SPR角隨著金屬表面折射率的變化而變化，而折射率的變化又與金屬表面結合的分子質量成正比。

Biacore的核心組件就是由微流路系統，光學組件及金膜芯片組成。金膜芯片上的蛋白和流路中的分子結合有解離的過程中，SPR角就會隨之發生變化，檢測器檢測到這種變化，根據此變化曲線作圖分析，可得出分子間的結合常數K_a、解離常數K_d或親和力常數K_D。

以免疫學分析為例，在金膜表面固定某種受體（如抗體）然后流過含相應配體（如抗原）的樣品，配體與受體的結合將使金膜與溶液界面的折射率上升，從而導致共振角發生變化。為了表述的方便，共振角（或共振信號）可以用共振單位（resonance units，RU）來表示。對大多數生物分子而言，1000RU大約等于1mm²的面積上有1ng的質量變化，相當于溶液中蛋白濃度為6mg/mL。SPR生物傳感器通過檢測獲得共振角的改變程度，便可以對配體濃度進行定量。

? SPR 是一種折光率傳感器，其響應值反映了SPR角度的改變 

? 響應信號依賴于芯片表面分子的濃度和溫度 

? 1 RU 的響應值大致上相當于芯片表面結合物質的濃度改變了1 pg/mm² (蛋白結合與CM5芯片) 

如下圖所示。

Biacore的核心組件包括：

SPR生物傳感技術的應用領域包括：生物大分子的相互作用；腫瘤研究；免疫學和傳染病；神經科學；生物制藥；蛋白質組學。

Biacore可研究的生物分子范圍包括：蛋白質；DNA/RNA；脂類/脂質體/生物膜；多糖；多肽；小分子；全細胞病毒/微生物。

可分析的對象：

Biacore核心組件

Biacore提供的生物分子相互作用信息包括：

• 有無結合（Yes or no）

• 結合的特異性和選擇性（Specificity）

• 兩種分子的結合強度-親和力（Affinity）

• 結合和解離的快慢和復合體的穩定性-動力學（Kinetics）

• 功能復合體形成的參與者、協同者和組裝順序（Mechanism）

• 分子結合的溫度與熱力學特征（Thermodynamics）

• 目標分子活性含量的檢測（Concentration）

SPR光學組件

微流控系統(IFC)具有的特性包括：集成化、自動化的微流路控制系統；樣品消耗量低；為互相作用分析而設計優化

微流控系統(IFC)-流動池的特點為：

IFC上有4個流動池；可選擇單獨、配對、串聯使用。流動池為配對使用進行了優化（Fc1-Fc2，Fc3-Fc4）

傳感芯片：

葡聚糖表面的特點：親水性；溫和型:和2%濃度的葡聚糖水溶液環境相似；非特異性結合量低；高結合容量；易于進行共價結合；出色的化學穩定性。

傳感芯片的選擇：

11種不同的芯片種類

• CM5，CM4，CM3：芯片、蛋白、肽段、小分子等

• CM7：小分子化合物研究

• SA芯片：生物素標記的分子，如核酸、糖類等

• Biotin CAP芯片：可逆性生物素捕獲芯片心

• NTA芯片：His重組蛋白

• L1芯片：模擬脂質雙分子層環境

• HPA芯片：實現膜系統相關的互作分析

• C1芯片：研究細胞、病毒等大顆粒分子

• Au裸金芯片：客戶定制表面（材料、高分子等）

30余種不同的試劑盒及緩沖液產品：

• 氨基偶聯試劑盒、巰基偶聯試劑盒；

• GST捕獲試劑盒 GST重組蛋白分析

• NTA捕獲試劑盒 His重組蛋白分析 

最常用的傳感器芯片：

Biacore實驗的基本流程

分析物和配體的定義

芯片表面預處理 – 偶聯/固定配體 (Immobilization) 

–什么是固定配體？ 

–將配體直接（共價）或者間接地 (通過捕獲分子) 固定于芯片表面；或稱為偶聯蛋白：在芯片表面偶聯分子Ligand或捕獲分子 

樣品進樣（Injection）的過程為：

• 分析物（Analyte）進樣后，以恒定的流速和濃度流過芯片表面

• 樣品中的待分析物與固定在芯片表面上的配體發生結合，芯片表面物質的質量發生改變，儀器記錄下對應的響應值（response）的改變

• 進樣結束后，切換緩沖液流過芯片表面，分析物由配體上自發解離，解離的進程由響應值實時監控

  
  

芯片再生（Regeneration）的過程為：

• 將自發解離后仍然結合于配體的分析物徹底洗掉

• 配體的結合活性必須保留。

傳感圖（The sensorgram）

實驗設計

選用CM5傳感芯片→在金膜表面固定表達純化后的D結構域蛋白→流過含抗體的樣品→抗體與D結構域蛋白的結合將使金膜與溶液界面的折射率上升，從而導致共振角發生變化→檢測蛋白與抗體的結合情況。