解讀2014Nobel化學獎：超分辨率熒光顯微技術

【摘要】2014年諾貝爾化學獎授予Eric Betzig，Stefan W. Hell和William E. Moerner3位科學家，以表彰他們在超分辨率熒光顯微成像技術方面的重大貢獻。本文從顯微鏡分辨率的起因入手，對超分辨熒光顯微技術進行了深入闡述。此外，對光學顯微技術的發展前景進行展望。

2014年諾貝爾化學獎授予發展超分辨率熒光顯微成像技術的3位科學家，他們分別是美國霍華德·休斯醫學研究所教授Eric Betzig、德國馬克斯普朗克生物物理化學研究所教授Stefan W. Hell和美國斯坦福大學教授William E. Moerner。

1 熒光顯微鏡的發明歷程

光學顯微鏡自發明伊始，即與生命科學結下了不解之緣。16世紀末期，荷蘭眼鏡商Zaccharias Janssen和他的兒子把兩個凸透鏡放到一個鏡筒中，結果發現鏡筒能放大物體，這就是顯微鏡的前身。隨后，荷蘭人Anthony Von Leeuwenhoek通過精密研磨的玻璃透鏡，首次將復式顯微鏡的分辨率提高到了300倍，并用它來觀察牙縫中的微生物——細菌。后來，英國實驗科學家Robert Hooke對這一顯微鏡進行了系統的改進，用它來觀察軟木塞的微小結構。他看到了上面致密排列的小室，并將其命名為細胞，記錄在他1665年創作的《顯微鏡》一書中。然而，Robert Hooke與當時的科學巨匠牛頓產生了極大的分歧：牛頓認為光是粒子，而Robert Hooke則認為光是波。由于牛頓的學術地位和性格，使得當時的波動學說受到極大的排擠。

圖 1 2014年諾貝爾化學獎得主，從左至右依次為Eric Betzig，Stefan W. Hell和William E. Moerner（圖片來源：Nobelprize.org） 

Fig. 1 The laureates of2014Nobel prize of Chemistry. Left to right: Eric Betzig,Stefan W. Hell,and William E. Moerner.

1872年，德國數學和物理學家Ernst Abbe根據光的波動性，得出了以下結論：對一個理想的發光點，在經過顯微鏡光學系統后，將是一個高斯型的艾里斑。其光強分布的半高全寬，其中，λ是光的波長，n是折射率，θ是聚焦光錐的半角。

圖 2 點擴展函數和阿貝分辨率極限 

Fig. 2 Point spread function and Abbe criterion

上述公式即阿貝公式，指明了3點：

1）由于光具有波動性，衍射將使得一個點不能被匯聚到另一個點（空間上沒有大小的delta函數），而是具有一定的大小，這個大小就是我們常說的分辨率。

2）對于顯微物鏡，可以通過水、油等折射率比較高的液體，得到更好的分辨率。

3）由于sinθ最大值是1，在可見光下（波長400~700nm），能夠獲得的最小分辨率大約是200nm。

無論一個樣品結構有多復雜，總是能夠描述為是由一個個點構成的，因此，這個點的像描述了光學系統的響應函數，或者稱之為系統的分辨率。該函數即點擴展函數。舉例來說，在晴朗的夜空，人眼所看到的一顆星星的圖像，就是人眼的點擴展函數。

通過阿貝公式，很容易想到的是，縮短波長即可產生更高的分辨率，比如利用X光。1986年，電子顯微鏡技術獲得了諾貝爾物理學獎。在電子顯微鏡中，電子的德布羅意波長僅為光波的千分之一，屬于X光，導致電子顯微鏡的分辨率達到0.1nm。這也進一步驗證了阿貝的衍射理論在麥克斯韋方程下的普適性。1955年，美國細胞生物學家GeorgeEmil Palade利用電子顯微鏡發現了核糖體。核糖體是細胞內蛋白質翻譯的工廠，它的發現對人類認識細胞功能邁出了重大的一步，George Emil Palade于1974年被授予諾貝爾生理學或醫學獎。

然而，生物學家對于電鏡可以說是愛恨交加。一方面，電鏡使得過去不能夠看到的樣品細節能夠被清晰地展現。但是，電鏡卻有著復雜、嚴苛的樣品制備過程，如切片、脫水、固定、鍍金等，這些均會破壞細胞的活性甚至改變其原有的結構。而且，電鏡只能看到細胞內的結構，對于所觀察到的結構的判斷，則需要其他技術輔助辨別。

另一方面，光學顯微需要所看的對象“色彩斑斕”，而細胞一般是高度透明的。為了能夠看到細胞內部結構，人們發明了染色技術。最常用的染色技術——HE染色能夠利用2種染料對生物組織進行染色，目前仍是臨床采用的判定腫瘤良惡性的金標準。

然而，染色對于觀察亞細胞結構仍存在較大挑戰：染色是通過對光的直接吸收來產生的反差，也就是讓細胞器有吸收，而周圍沒有吸收達到反差效果。光的吸收率可以用比爾定量描述：α=1-e^-μl，其中μ為吸收系數，l是樣品的厚度。當l非常小時，吸收率幾乎為0，這也就是薄樣品看上去幾乎透明的原因。

傳統的染色是吸收A波長，探測A波長的吸收率。為了解決這一問題，可以使系統吸收A波長，探測從樣品染色上發出的B波長。這樣，僅在有“染色”的地方發光，沒有染色的地方是完全黑的，即熒光染色。1871年，Johann FriedrichWilhelm Adolf von Baeyer因合成熒光素獲得1905年諾貝爾化學獎。在此基礎上，能夠特異性地標記細胞中的不同細胞器的熒光染色技術應運而生。2008年諾貝爾化學獎的綠色熒光蛋白能夠通過外源性標記或者內源性轉基因的方式選擇性地讓某一個感興趣的細胞器發熒光，將活體成像往前推進了一大步。

對比熒光顯微的圖像和HE染色（圖 3）可以發現，熒光染色在沒有細胞器的地方是完全黑的，這就使得熒光顯微有著傳統染色無可比擬的高對比度。

 圖 3 HE染色病理切片圖（a）與細胞熒光顯微圖（b）的對比

Fig. 3 Comparison of histological HE stain result (a) and cellular fluorescent imaging result (b)

“工欲善其事，必先利其器”。要想探究生命的奧秘，首先就需要能夠看清楚。然而不幸的是，很多亞細胞結構、細胞器和生物大分子的典型尺寸在幾個到數百納米，而光學顯微的分辨率早在200年前就被阿貝公式限定在200nm，遠遠不能滿足生命科學的需求。

2 超分辨率熒光顯微技術

傳統的分辨可以定義為：如果點擴展函數較大，那么對于兩個靠得很近的點，則不能分辨。在此基礎上，實現超分辨的方法可分為兩類：

（1）基于點擴展函數調制的超分辨技術，使得點擴展函數變小；

（2）基于隨機單分子定位的超分辨技術，使得沒有靠得很近的兩個點同時發光。

基于點擴展函數調制的超分辨技術的代表為受激發射光淬滅（簡稱STED）技術。其基本思想是，在一個點擴展函數PSF1的基礎上，用另一個環形點擴展函數PSF2去擦除PSF1的外圍（抑制其外圍發熒光），導致PSF1-PSF2剩下的光子為僅從PSF1中心發出，也就是點擴展函數變得更小。早在1994年，此次獲獎的羅馬尼亞裔德國科學家Stefan W. Hell（當時還是博士后）最先提出了打破光學衍射極限的構思，并最終于2000年在實驗上得以實現[1]。在物理上，他通過受激輻射的原理，利用受激輻射進行環狀擦除。由于這一方法所產生的點擴展函數不再受到衍射極限的限制，而僅僅取決于擦除的程度（擦除后剩下的區域大小），因此它的分辨率可表達為：。

從2000年開始，他不斷改進STED技術，使其更加適用于生物研究。2006年，他展示了STED在綠色熒光蛋白上的應用[2]；2008年，他實現了STED實時超分辨觀察細胞囊泡的運動[3]；2012年，他報道了利用STED進行活小鼠的神經突觸生長過程的連續觀測的成果[4]。另外，還通過其他光調制原理發明了一系列的超高分辨率技術，統稱為可逆飽和熒光躍遷（RESOLFT），為超分辨率熒光顯微成像技術的發展做出了巨大貢獻。

圖 4 STED超分辨率成像原理示意圖 

Fig. 4 Principle of STED super-resolution microscopy

基于結構照明原理的超高分辨率技術是美國科學家Mats Gustafsson于2000年發明的，非常適于細胞研究，可惜分辨率只能提高1倍。該技術是基于兩個高空間頻率的圖案重疊可以形成低頻率莫爾條紋的原理，通過解析低頻莫爾條紋實現超高分辨率成像。在此基礎上，Mats Gustafsson發明了飽和SIM，能夠利用熒光飽和實現更高的分辨率，其本質也是點擴展函數的縮小。可惜Mats Gustafsson于2011年51歲時因癌癥去世，無緣分享此次諾貝爾獎。

基于隨機單分子定位的超分辨技術的核心是，如果圖像上的點不是同時亮起來，也就是不會有兩個靠得很近的點同時亮，就可以通過定位的方式實現超分辨。雖然一次定位只能得到少數幾個分子，但是通過數千張圖片對數十萬個單分子的定位，就可以獲得一張高分辨率的圖像。

圖 5 基于隨機單分子定位的PALM/STORM超分辨原理圖 

Fig. 5 Diagram of the localization based PALM/STORM super-resolution microscopy

這一超分辨技術發明于2006年，由本次諾貝爾獎得主Eric Betzig（光活化定位顯微術PALM技術）[5]、哈佛大學教授莊小威(隨機光學重構顯微術STORM技術）[6]、以及SamuelHess（熒光活化定位顯微術fPALM技術）[7]3個研究組分別同時獨立發明，分別發表于Science，Nature Methods和Biophysical Journal。3種技術的原理非常像，都是基于熒光分子的光轉化能力和單分子定位，通過用光控制每次僅有少量隨機離散的單個熒光分子發光，并準確定位單個熒光分子點擴展函數的中心，通過多張圖片疊加形成一幅超高分辨率圖像。

William E. Moerner是單分子熒光技術的先驅人物。他在1989年任職于美國IBM研究中心時在世界上首次實現了單個分子的光吸收的測量[8]，并在1997年與發展綠色熒光蛋白技術而獲得2008年諾貝爾化學獎的錢永健合作，發現了綠色熒光蛋白的光轉化效應[9]。而Eric Betzig是熒光顯微技術領域的領軍人物。他在1994年提出了基于單分子信號實現超高分辨率成像的思想[10]，并于2006年在實驗中得以實現。莊小威作為STORM超分辨技術的發明人，一直領導并推進著超高分辨率顯微技術的發展和應用，是近8年來這個領域最活躍的研究團隊。

3 我國超分辨率光學顯微技術發展現狀

在中國，目前有數十家單位在進行超分辨率顯微方面的研究工作，在研究上緊跟國際潮流。比如，本文作者北京大學席鵬于2010年首次在國內實現了STED超分辨[11,12,13]，其后浙江大學劉旭[14]、中國科學院化學研究所方曉紅[15]等課題組也報道了STED超分辨技術的進展。在PALM/STORM研究方面，北京大學孫育杰課題組一直在進行單分子成像和層狀光成像方面的研究[16, 17]，中國科學院生物物理研究所徐濤、徐平勇課題組研發新型光開關蛋白[18]、華中科技大學黃振立課題組開發新型定位算法等[19]。在結構光成像方面，中國科學院西安光學精密機械研究所姚保利課題組報道了基于DMD光調制的SIM[20]。在高速并行三維超分辨成像方面，席鵬課題組最近報道了一系列基于SOFI的超分辨技術[21, 22]。

當前，我國在超分辨率顯微技術方面，已經有一支完善的研究隊伍。擺在我們面前的首要問題是如何結合這些超分辨技術和其他光學技術，取長補短，實現更清（更高空間分辨率）、更快（更高時間分辨率）、更深（組織三維成像）方面的突破，向著活體三維動態超分辨方向不斷推進。

4 未來：更清、更快、更深

超分辨率顯微作為一類很新的技術，突破了光學成像中的衍射極限，把傳統成像分辨率提高了10～20倍，成為研究細胞結構的利器。過去七八年間，這些技術不斷推進，先后實現了多色、三維和活細胞高速成像。其生物應用也很廣泛，包括細胞膜蛋白分布、細胞骨架、線粒體、染色質和神經元突觸等。超高分辨率技術一經出現就引起廣泛關注，先在2006年被Science評為年度10大技術突破，隨后被生物醫學方法學最好的期刊Nature Methods評為2008年度方法。在2014年9月Nature Methods的10周年特刊評出的10年10大技術中，超高分辨率成像和單分子技術也都出現在榜中。

科技的進步，有賴于站在巨人的肩膀上，將其他技術有機地與自己的技術相結合。2005年的《生物技術當今觀點》刊文指出了過去的光學顯微的方法，如寬場、共聚焦、多光子、非線性、全內反和今天的超分辨技術之間的演進關系[23]。雖然經過10年的發展，超分辨顯微在三維空間分辨率的提升上有了長足進步，然而這往往是以犧牲時間分辨率為代價的。未來的技術進步，需要在并行化、高速、活細胞和活組織方面，實現超高時空分辨活體成像。最近，Hell課題組將所有的超分辨技術——STED的環形光、SIM的條紋、PALM/STORM的光開關蛋白有機結合，實現了并行的超分辨，將超分辨率顯微的速度大幅提升[24, 25]。

歷史總是在自我重復中不斷前進。在1903年，RichardZsigmondy發明了超顯微鏡，這一顯微技術因其分辨率能夠突破波長尺度而獲得1925年諾貝爾獎。由于它提供了全新的研究問題的尺度，人們甚至將它看作是納米科技的起始[26]。在2004年，這一技術在層狀光照明顯微中得到新的應用，同時被評為Nature Methods10大年度方法[27]。那么，古老的諾獎超顯微技術，會不會和今天的諾獎超分辨率熒光顯微擦出新的思想火花呢？

后記：寫下初稿的時候剛好是諾貝爾獎公布的時間。2014年11月，Eric Betzig發表在Science的工作，將Light sheet與超分辨結合，對活體胚胎進行成像[28]。這一技術向更清、更快、更深邁出了新的一步，也印證了我們文終提出的問題。 

席鵬,孫育杰.超分辨率熒光顯微技術——解析2014年諾貝爾化學獎[J].科技導報,2015,33(4):17-21.  

XI Peng, SUN Yujie. Super-resolution fluorescent microscopy: commentary on the 2014 Nobel Prize in Chemistry. Science & Technology Review, 2015, 33(4): 17-21.   

關鍵詞： 2014年諾貝爾化學獎     超分辨     光學顯微    

Super-resolution fluorescent microscopy: commentary on the 2014 Nobel Prize in Chemistry

Abstract: The 2014 Nobel Prize in Chemistry is awarded to three scientists (Eric Betzig, Stefan W. Hell and William E. Moerner), for the development of super-resolved fluorescence microscopy. Based on the principle of the resolution in optical microscopy, we gave an in-depth analysis of the origin of super- resolution microscopy. We also present an outlook for the future development of optical microscopy.

Key words: 2014Nobel prize in Chemistry     super-resolution     optical microscopy  

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