詳述補體結合試驗

補體結合試驗中有5種成分參與反應，分屬于3個系統：①反應系統，即已知的抗原（或抗體）與待測的抗體（或抗原）；②補體系統；③指示系統，即SRBC與相應溶血素，試驗時常將其預先結合在一起，形成致敏紅細胞。反應系統與指示系統爭奪補體系統，先加入反應系統給其以優先結合補體的機會。

如果反應系統中存在待測的抗體（或抗原），則抗原抗體發生反應后可結合補體；再加入指示系統時，由于反應液中已沒有游離的補體而不出現溶血，是為補體結合試驗陽性。如果反應系統中不存在的待檢的抗體（或抗原），則在液體中仍有游離的補體存在，當加入指示系統時會出現溶血，是為補體結合試驗陰性。因此補體結合試驗可用已知抗原來檢測相應抗體，或用已知抗體來檢測相應抗原。

補體結合試驗的改良方法較多，較常用的有全量法（3ml）、半量法（1.5ml）、小量法（0.6ml）和微量法（塑板法）等。目前以后兩種方法應用較為廣泛，因為可以節省抗原，血清標本用量較少，特異性也較好。以下敘述以小量法為例，即抗原、抗體、溶血素、羊紅細胞各加0.1ml，補體加0.2ml，總量為0.6ml。

（l）巴比妥緩沖液（BBS）：稱取氯化鈉85.0g，氯化鎂六水合物1.68g，氯化鈣0.28g，巴比妥5.75g，巴比妥鈉2.0g，先將巴比妥加入500ml水中加熱溶解后，再加其他成分，補加水至2000ml，此為保留液，用時稀釋5倍。

（2）抗體（溶血素）：應無抗補體現象，國內有商品供應。

（3）2%羊紅細胞：用生理鹽水離心洗滌后，用BBS配成2%懸液。

（4）補體：豚鼠血清。

1．抗原試驗中用于檢測抗體的抗原應適當提純，純度愈高，特異性愈強。如使用粗制抗原時，須經同樣處理的正常組織作抗原對照，以識別待檢血清中可能存在的、對正常組織成分的非特異性反應。

2．抗原和抗本的滴定補體結合試驗中，抗原與抗體按一定比例結合，因而應通過試驗選擇適宜的濃度比例。多采用方陣法進行滴定，選擇抗原與抗體兩者都呈強陽性反應（100％不溶血）的最高稀釋度作為抗原和抗體的效價（單價）。滴定方法舉例如表14-4。在試管中加入不同稀釋度的抗原，配加不同稀釋度的抗血清，另作不加抗原的抗體對照管和不加抗血清的抗原對照管。按照試驗方法加補體和指示系統，溫育后觀察結果。在表14-4中可見1:64抗原和1:32抗體各作為1個單位。在正式試驗中，抗原一般采用2～4個單位（1:64～1:32），抗體采用4個單位（1:8）。

3．補體滴定按表14-5逐步加入各試劑，溫育后觀察最少量補體能產生完全溶血者，確定為1個實用單位，正式試驗中使用2個實用單位。如形14-5中的結果為1:60的補體0.12ml可產生完全溶血，按比例公式0.12×2:60＝0.2:X計算，X＝50；即實際應用中的2個補體實用單位應為1:50稀釋的補體0.2ml。

采集血液標本后及時分離血清，及時檢驗或將血清保存于－20℃。血清在試驗前應先加熱56℃30min（或60℃3min）以破壞補體和除去一些非特異因素。血清標本遇有抗補本現象時可做下列處理之一：①加熱提高12；②－20℃凍融后離心去沉淀；③以3mmol/L鹽酸處理；④加入少量補體后再加熱滅活；⑤以白陶土處理；⑥通入CO₂；⑦以小白鼠肝粉處理；⑧用含10％新鮮雞蛋清的生理鹽水稀釋補體。

溶血素的滴定：

①取補體1ml，加BBS 9ml，依次稀釋成1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶80，1∶100，1∶200，1∶400，同時取50%的溶血素0.2ml，加BBS 9.8ml，即為1∶100的溶血素，然后繼續稀釋成1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400。

②采取方陣排列試管，縱行各管加不同濃度的補體0.1ml，橫排各管加溶血素0.1ml（皆應從最高稀釋度加起）混勻后，各管加BBS 0.2ml，補體和溶血素對照管各加BBS 0.3ml，最后在各管中加2%羊紅細胞0.1ml。各管總量為0.5ml，搖勻，放37℃水箱中30min，觀察結果。以完全溶血的補體和溶血素最高稀釋度為各自的單位。在實際應用時，溶血素用2U（3200÷2=1600），補體用2.5U（80÷2.5＝32）。

（2）正式試驗：

①用V型微量反應板操作，每份標本作一個試驗孔。一個血清對照孔。各孔內先加BBS 0.025ml。②用稀釋棒蘸取血清（0.025ml）加入第一孔，旋轉后移入第二孔，共八孔，如此可得1∶2～1∶256稀釋。③按表2加入各試劑：

以小量法測定抗體的補體結合試驗為例。按表14-6逐步加入各種試劑，溫育后先觀察各類對照管，應與預期的結果吻合。陰性、陽性對照管中應分別為明確的溶血與不溶血；抗體或抗原對照管、待檢血清對照管、陽性和陰性對照的對照管都應完全溶血。綿羊紅細胞對照管不應出現自發性溶血。補體對照管應呈現2U為全溶，1U為全溶略帶有少許紅細胞，0.5U應不溶。如0.5U補體對照出現全溶表明補體用量過多；如2U對照管不出現溶血，說明補體用量不夠，對結果都有影響，應重復進行試驗。補體結合試驗結果，受檢血清不溶血為陽性，溶血為陰性。補體結合試驗是一種傳統的免疫學技術，能夠沿用至今說明它本身有一定的優點：①靈敏度高。補體活化過程有放大作用，比沉淀反應和凝集反應的靈敏度高得多，能測定0.05μg/ml的抗體，可與間接凝集法的靈敏度相當。②特異性強。各種反應成分事先都經過滴定，選擇了最佳比例，出現交叉反應的機率較小，尤其用小量法或微量法時。③應用面廣，可用于檢測多種類型的抗原或抗體。④易于普及，試驗結果顯而易見；試驗條件要求低，不需要特殊儀器或只用光電比色計即可。

補體結合試驗可應用在以下幾方面：①傳染病診斷。病原性抗原及相應抗體的檢測。②其他抗原的檢測。例如腫瘤相關抗原、血跡中的蛋白質鑒定、HLA分型等。③自身抗體檢測。

但是補體結合試驗參與反應的成分多，影響因素復雜，操作步驟繁鎖并且要求十分嚴格，稍有疏忽便會得出不正確的結果，所以在多種測定中已被其他更易被接受的方法所取代。但對于免疫學技術的基本訓練仍是一個很好的試驗。