誘餌蛋白特性鑒定實驗

蛋白質

CM培養基

水浴鍋 培養箱 電轉儀

一、lacZ激活試驗

1.  采用標準的亞克隆技術，將編碼目的蛋白質的DNA插入pEG202的多接頭中，構建一個符合讀框的融合蛋白。

2.  將下列組合的質粒，分別按“乙酸鋰轉化法”轉化酵母菌EGY48。

（1）pBait+pSH18-34（實驗組）

（2）pSH17-4+pSH18-34（激活陽性對照組）

（3）pRFHM1+pSH18-34（激活陰性對照組）

3.  將轉化混合物涂布于Glc/CM-Ura-His 省卻成分培養基平板，于30℃培養過夜，選擇含兩種質粒的酵母菌。

4.  將上步獲得的三種轉化子（實驗組，陽性對照和陰性對照組）分別各挑至少5或6個單菌落，并將毎個克隆劃在一個Glc/CM-Ura-His 省卻成分培養基的主平板上。 

5.  將一塊尼龍膜輕輕地放在含酵母菌的平板上，待其完全浸濕后取出，尼龍膜在空氣中干燥5 min，將沾有菌落的一面朝上，于-70℃冷凍10 min。

6.  取一張浸泡在含1 mg/ml Xgal的1×Z緩沖液中的Whatman 3MM 濾紙，將尼龍膜置于其上，菌落面朝上。或者直接將尼龍膜放在盛有約2 ml 含1 mg/ml Xgal 的Z緩沖液的培養血中，于30℃溫育并現察克隆的顏色變化。

二、抑制試驗

7.  將以下組合的質粒分別轉化酵母菌EGY48

（1）pBait+pJK101（實驗組）

（2）pRS423+pJK101（抑制試驗陰性對照組）

（3）pRFHM1+pJK101（抑制試驗陽性對照組）

8.  將每一種轉化混合物涂布于Glc/CM-Ura-His 省卻成分培養基平板上，以便選擇具有一對轉化質粒的酵母菌細胞，于30℃培養直至菌落出現，通常需要2~3天，但不能超過4天。
 

圖一、pEG202 LexA-融合質粒

9.  轉化后生長出來的單菌落劃線在Glc/CM-Ura-His 省卻成分培養基平板上，并于30℃培養過夜。

10.  通過液體檢測試驗（使用Gal/CM 省卻成分培養基），復印膜分析，或結合兩種檢測方法。檢測3組轉化酵母菌株中的β-半乳糖苷酸活性（實驗組，陽性對照組，陽性對照組）。

三、LEU 2 試驗

11.  取一個轉化pBait和pSH18-34報道質粒的EGY48酵母菌單菌落，分散于500 μl 無菌水中，取出其中100 μl 稀釋在1 ml 無菌水，并用無菌水作1/10倍比連續稀釋至1 000倍。

12.  從每一個稀釋濃度各取100 μl 分別涂布Glc/CM-Ura-His 省卻成分培養基平板和Glc/CM-Ura-His-Leu 省卻成分培養基平板，于30℃培養過夜。

13.  選擇能作為相互作用阱進行文庫選擇的克隆；合適的pBaits 應不能激活lacZ 和leuZ 報道基因，要求產生的β-半乳糖苷酶活性比JK101+pRS423 低，與JK101+RFHM1 相當。pBaits 具有較低的激活活性可能也適用的，如pBaits 具很強的激活活性，應該加以截短。