諾如病毒的實驗室檢查

諾如病毒是一組杯狀病毒科的病毒，以前也稱之為“諾瓦克樣病毒”。諾如病毒感染影響胃和腸道，引起胃腸炎或“胃腸流感”。“胃腸流感”不同于流感病毒引起呼吸道疾病的流感。

   諾如病毒感染性腹瀉是由諾如病毒屬病毒引起的腹瀉，具有發病急、傳播速度快、涉及范圍廣等特點，是引起非細菌性腹瀉暴發的主要病因。諾如病毒感染性強，以腸道傳播為主，可通過污染的水源、食物、物品、空氣等傳播，常在社區、學校、餐館、醫院、托兒所、孤老院及軍隊等處引起集體暴發。

   諾如病毒遺傳高度變異，在同一時期和同一社區內可能存在遺傳特性不同的毒株流行。諾如病毒抗體沒有顯著的保護作用，尤其是沒有長期免疫保護作用，極易造成反復感染。 

   諾如病毒感染性腹瀉在全世界范圍內均有流行，全年均可發生感染，感染對象主要是成人和學齡兒童，寒冷季節呈現高發。美國每年在所有的非細菌性腹瀉暴發中，60-90%是由諾如病毒引起。荷蘭、英國、日本、澳大利亞等發達國家也都有類似結果。在發展中國家，諾如病毒感染性腹瀉普遍存在，也常引起暴發流行。在我國5歲以下腹瀉兒童中，諾如病毒檢出率為15%左右，血清抗體水平調查表明我國人群中諾如病毒的感染亦十分普遍。1995 年，我國報道了首例諾如病毒感染，之后山西、北京、安徽、福州、武漢、廣州等地區先后發生多起諾如病毒感染性腹瀉暴發疫情。

   標本采集

   糞便標本應在發病首日采集，至多不能超過發病急性期(48～72h)，此時為稀、軟便，病毒排出量最多。一次流行，至少采集10例患者糞便，每份標本量約1～5ml，成形便和肛拭子診斷意義很小。標本置4℃可存放2～3周，運送也要低溫條件。病人嘔吐物是糞便標本的最佳補充，有助于病原的診斷。該標本的采集、儲存和運送條件同于糞便。從流行病學角度出發，在水、食物或其它外環境標本中檢出NV意義重要。需注意檢測技術要鎖定在高度懷疑的傳播媒介上，盡早采樣并置4℃存放，若是飲用水，需用大容量(5～100L)濃集病毒后檢測。

   實驗室檢查

   電鏡法

   直接電鏡法(EM)和免疫電鏡法(IEM)，EM 法觀察的靈敏度較低，要求每毫升糞便樣品中至少有大約 106個病毒粒子，因此只能用于患病早期病毒大量排出時采集的樣本檢測。IEM 法比 EM 法的敏感性可提高 100 倍，主要應用患者恢復期血清捕捉同型抗原，從而增加檢出率。電鏡法的缺陷在于設備昂貴，不能廣泛普及；檢測結果與操作者的技能和經驗有直接關系；靈敏度相對較低；不適于大規模流行病學調查。

   免疫法

   包括放射免疫法(RIA)、生物素-親和素免疫法(Biotin-Avidin Immunoassy)和酶聯免疫法(ELISA)。RIA法的靈敏度比IEM 法可 提高10～100倍，可以檢測出抗體升高的水平，為流行病學提供更有參考價值的資料。RIA 法的不足之處在于它需要 6 d，且需要放射性同位素標記。為了簡化方法，美國疾病預防控制中心建立了生物素-親和素免疫法，其靈敏度與 RIA 法相當，目前該方法已成為美國疾病預防控制中心檢測NLV抗原和抗體的標準實驗方法之一。1992年Jiang 等重組桿狀病毒表達諾如病毒（NV）衣殼蛋白成功后，建立起的 NV 酶聯免疫檢測方法快速、靈敏、經濟，其不足之處是免疫反應的株型特異性太強，所以應用范圍還比較窄。酶鏈免疫法特異性強，靈敏度高，診斷迅速，且較經濟，是目前可廣泛應用的檢測方法。由于NLV培養還未成功，原來用作試劑的病毒抗原數量受到限制，現在，用分子生物學技術已經可以人工重組NV的衣殼蛋白，從而解決了上述問題。 

   分子生物學檢測方法

   雜交技術和逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)除了能更準確、靈敏地檢測標本中的NV，尤其是低濃度的NV感染外，最大的優點在于可以進一步對病毒進行基因型的研究，不會受到獲得分型單克隆抗體的限制，對流行病學研究具有重要意義。 

   等溫核酸擴增法 (NASBA)直接擴增RNA 來檢測 NV，樣品中病原RNA得到指數級擴增，產物通過瓊脂糖凝膠電泳或斑點印跡雜交鑒定結果。該方法的靈敏度略低于 RT-PCR 法；整個過程只有一步RNA擴增，避免了RT-PCR存在的RNA交叉污染；縮短了操作時間；假陽性率低。

   食物中NV的檢測

   RT-PCR檢測食物中NV存在樣品病毒量含量低，樣品量大且成分復雜等問題，因此病毒富集濃縮、樣品處理是檢測的關鍵，其中有兩個重要方面影響檢測結果，一是樣品中病毒濃縮后的回收率，二是抽提核酸的完整程度和純度。

   病毒濃縮

   病毒濃縮 NV 濃縮方法一般分為兩大類，一類為有機絮凝沉淀法，主要使用聚乙二醇（PEG）沉淀，PEG 是具有強烈吸水性以及凝聚和沉淀蛋白作用的高分子聚合物，先改變樣品 pH 值，使毒粒與樣品微粒分開，PEG 把病毒沉淀下來，達到濃縮的目的。目前對于固體樣品 PEG 沉淀法是最有效的濃縮方法。
 

    膜過濾法是另一類有效濃縮病毒的方法，通過改變膜的pH值使之與帶有電荷的毒粒結合捕捉病毒，這種方法通常用在濃縮大體積的黏度小、內容顆粒小的液體食品或水中。檢測海水、生活污水中的NV曾用過這種方法，為瓶裝水和其他飲料濃縮NV提供了參考。

   核酸提取

   食品樣品成分復雜，所含有的脂肪、蛋白質、金屬離子等物質都是 RT-PCR 反應抑制因子。NV是單鏈RNA病毒，核酸提取方法的優劣取決于兩個方面：核酸的質量和去除抑制因子的能力。目前應用較成熟廣泛的是胍法 RNA 提取法，即（異）硫氰酸胍-苯酚-氯仿聯合裂解抽提法，該方法改進后制成市售的TRIzol、RNAzol、Ultraspec 等產品，與石英砂、磁珠等多孔顆粒相結合，已結合了poly(dT) 或特異探針的磁珠能較高程度的提純mRNA，去除反應抑制因子。石英砂或磁珠純化 RNA與傳統的有機試劑（異丙醇、乙醇）沉淀 RNA 相比起來，效果較好，只是成本偏高。