謝曉亮：從單細胞研究到高通量測序

　　2011年7月第八期《自然—方法學》刊登了Monya Baker撰寫的一篇人物特寫，詳細介紹了在當期發表的論文 “Fluorogenic DNA sequencing in PDMS microreactors”的主要作者哈佛大學謝曉亮教授的高通量測序技術。全文翻譯如下：

　　在科學界，合情合理的實驗也可能會出現令人吃驚的結果。當談到他的實驗室時，謝曉亮把他的主要研究分成三個領域：活體細胞中的動態基因表達研究，單分子酶學和免標記顯微成像技術，而現在，又多了一個由于意外而誕生的新領域——高通量測序。

　　目前常見的測序技術“焦磷酸測序”是通過邊合成DNA邊測序實現的，當加入新三磷酸核苷酸時，熒光素酶水解三磷酸鍵所產生的能量會以光的形式發出，然而光信號轉瞬即逝，需要檢測系統能夠靈敏地捕捉到這一瞬間的光信號。 另一種常見的技術是基于熒光的測序，相比之下，它可以產生一個穩定的光信號，但需要很多額外的化學修飾步驟才能產生熒光。在這篇Nature Method 的文章中（指Sims, P.A., Greenleaf, W.J., Duan, H. & Xie, X.S.. Nat. Methods 8, 575–580 (2011).），謝曉亮和他的同事們推出了一種新型的測序技術，這種技術兼顧焦磷酸測序的簡單流程和熒光檢測的穩定信號，這使得高精確度并循環周期短的測序成為可能。

　　單分子熒光酶學的開端要追溯到十多年前，當時謝曉亮作為美國太平洋西北國家實驗室的一位研究員，正在研究表征單個酶分子活性的方法，為此，他和同事曾應用過一個含有可發熒光的吖啶黃素基團的酶。那時，諸如 Helicos和Pacific Bioscience等公司也剛剛宣布了他們的DNA單分子測序計劃。謝曉亮對把單分子酶學應用于DNA測序領域很感興趣，但由于他已經在哈佛就職，這個想法僅僅被擱置于ZL層面。“我需要學著做個教授”，謝曉亮說。

　　謝曉亮偶爾會嘗試把基于熒光基團測序的想法推薦給一些研究生或博士后，但是年輕的科學家們通常不大敢嘗試這一想法。“提些建議對我來說是很容易的，因為我有很多項目，總有一些會成功的”，謝曉亮解釋道，“但是對學生來說這是個很大的賭注，并不是所有人都敢于接受這種挑戰。”一位四年級的研究生Peter Sims聽說了這個想法，當即接受了這個挑戰，盡管當時他完全可以由單分子馬達在活細胞的研究來獲得學位。 Sims表示這種潛在的高通量測序激發了他的濃厚興趣，但是對于所需的在核酸上修飾熒光基團的化學工作，他還沒有經驗。“他當時剛剛涉足于此，才開始學習”，謝曉亮說。謝曉亮和Sims共同商定了一個期限，如果Sims在此之前還沒有獲得顯著的成績，他就退回到原來的課題上，開始寫畢業論文。

　　捕捉熒光信號就像成功產生熒光一樣重要。在博士后William Greenleaf幫助下，他們解決了這個難題。“微反應容器和熒光化學二者的結合，便是這項測序新技術的精髓。”謝曉亮說。Greenleaf設法加工出了這些含有微反應容器的芯片，它是由可以重復密封的聚二甲基硅氧烷（PDMS）聚合物制成。謝曉亮說，沒有這種材料，他的實驗室的研究人員不可能做出這種嘗試。“我想把推廣PDMS的功勞歸于George Whitesides（George也在哈佛大學工作）”，他說，“基于PDMS我們才能夠制作出各式各樣的芯片上的實驗室，而且他們真的很好用。”

　　但是研究進展并非一帆風順。在后來的實驗中，含有熒光基團的分子總是會擴散到PDMS 中或是產生一些不可信的偽信號。實驗室的另一位成員段海峰加入了他們的小組，負責合成新型的熒光分子。此時，Sims和謝曉亮定下的期限也快到了，但他們仍沒有做出很好的結果。

　　Sims和Greenleaf制定了另外一項計劃，但是僅僅是對多拷貝的DNA測序而并非單分子測序。當時謝曉亮正在蘇格蘭出差，一天深夜他和Sims進行了一次電話長談，討論Sims是否應該退回到原來的項目來寫畢業論文。謝曉亮回憶道：“那真費了我好大一筆電話費。我說，‘Peter，請你再想想，我們再盡快地嘗試一下，如果你真的做到了，學術界將對你的畢業論文產生極大的興趣。’”幾周后，他們果真拿到了數據，并且Sims在他的答辯中成功地闡述了這種測序方法。謝曉亮富有哲理地說：“你開始一直在對著一堵墻作戰，后來你稍微改變了方向，這就大不一樣了”。Sims也有另外的動機，他曾和謝曉亮開玩笑說，“我做這個只是想畢業。”

　　雖然這項測序技術本身還是基于DNA擴增的，但謝曉亮希望它能為通用單細胞基因組測序提供一條道路。謝曉亮說：“盡管我們的技術并不是我最初希望的DNA 單分子檢測，但它依然為單細胞中DNA單分子測序提供了可能。”