谷胱甘肽S轉移酶融合蛋白的表達及純化實驗

大腸桿菌

氨芐青霉素 LB PBS SDS 甘油 谷胱甘肽

離心機 搖床 轉子 超聲波發生器

1.  按正確讀框將DNA片段亞克隆入合適的pGEX載體中，轉化大腸桿菌感受態細胞， 在LB/氨芐青霉素平皿上篩選轉化子，以不插入外源DNA的自連載體作對照，平皿置37℃孵育12~15 h。

2.  挑取轉化菌落接種于2 ml LB/氨芐青霉素培養基，并在氨芐青霉素主平板上劃線培養。同時接種含母本pGEX載體的轉化菌作對照。將主平板于37℃下溫育12~15 h。液體培養物則于37℃搖床中振蕩培養，直至混濁。

3.  加入100 mmol/l IPTG至終濃度0.1 mmol/l 誘導融合蛋白表達，繼續保溫培養1~ 2 h。

4.  將液體培養物移入一個作好標記的微量離心管中，室溫下以最高速度離心5 s，棄上清，沉淀用300 μl 冰浴預冷的PBS液重懸。取10 μl 入另一個作好標記的離心管中 。

5.  用帶直徑2 mm 探頭的超聲波發生器破碎細胞，4℃下高速離心5 min，除去不溶性物質， 將上清移入一新的離心管中。

6.  毎管上清加50 μl 50%谷胱甘肽-瓊脂糖珠混懸液，室溫下輕柔混勻，加1 ml PBS用旋渦混合器短暫振蕩旋起，高速離心5 s，收集瓊脂糖珠，棄去上清，重復用PBS洗滌2次。

7.  往冼過的瓊脂糖珠中加等體積的1×SDS樣品緩沖液，另加入30 μl 于10 μl 的全細胞 重懸液中，100℃加熱3 min，用旋渦混合器短暫振蕩旋起后，加樣于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，電泳適當時間，用考馬斯亮藍染色使GST蛋白和融合蛋白顯跡。

8.  挑取一個pGEX轉化菌落接種于100 ml LB/氨芐青霉素培養基中，在37℃搖床中培養12~15 h。

9.  以1：10比例將此培養物稀釋于1 L 新鮮的LB/氨芐青霉素培養基中，分入兩個2 L 的瓶中，37℃下培養1 h。

10.  加100 mmol/l IPTG至終濃度0.1 mmol/l，繼續培養3~7 h。

11.  室溫下5 000 g 離心10 min，收集細胞，棄上清。沉淀重懸于10~20 ml 冰浴預冷的PBS中。

12.  將離心管置于冰浴，用帶直徑5 mm 探頭的超聲波發生器裂解細胞，調整頻率和強度避免產生泡沫，伹使裂解于30 s 內完成。 

13.  加入10%的Triton X-100至濃度為1%并混勻。室溫下10 000 g 離心5 min 除去不溶性成份和未裂解的細胞。或取1.5 ml 一份的樣品，4℃以微量離心機在最大速度離心5 min，收集上清（小心避免吸入沉淀）。

14.  上清加入1 ml 50%的谷胱甘肽-瓊脂糖珠混懸液中，室溫下輕柔混勻≥2 min。加50 ml 冰浴預冷的PBS液洗滌、混勻，在臺式離心機上500 g 離心10 s。重復洗滌2次，用少量（1~2 ml）冰冷的PBS重懸瓊臘糖珠，并移入一個1. 5 ml 微量離心管中。
 

15.  室溫下500 g 離心10 s，收集瓊脂糖珠，棄上清。加1 ml 50 mmol/l Tris·Cl（pH8.0）/5 mmol/l 還原型谷胱甘肽冼脫融合蛋白。輕柔混勻2 min，500 g 離心10 s，收集上清， 重復冼脫2~3次，經SDS-PAGE分析各分部收集的樣品。洗脫的蛋白質分成小份，加甘油10%貯存于-70℃。測量280 nm 下的吸光度確定融合蛋白產量，對GST載體來說，A₂₈₀=1相當于蛋白質濃度為0.5 mg/ml。