質粒DNA的大量制備實驗

培養基 菌株

EDTA SDS 乙醇 乙酸鉀 異丙醇

離心管

1.  往5 ml的含選擇性試劑（通常是氨芐青霉素）的LB培養基或豐富培養基接種單菌落。于37°C劇烈振蕩培養過夜。

2.  往2 L燒瓶中加入500 ml含有適當抗生素的LB培養基，然后加人1 ml過夜培養的大腸桿菌培養物，再于37°C培養至飽和狀態（OD₆₀₀≈4）。
 

3.  于 4°C，6000 g 離心 10 min。

4.  用4 ml GTE溶液重懸沉淀，并轉移到一個容積≥20 ml的高速離心管中。

5.  加入1 ml新配的含25 mg/ml溶菌酶的GTE溶液（終濃度5 mg/ml），徹底重懸沉淀，于室溫放置10 min。

6.  加人10 ml新配的NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而黏稠。于冰上放置10 min。

7.  加人7.5 ml 3 mol/L乙酸鉀溶液，用吸管輕輕攪拌直至黏稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置10 min。

8.  于4 °C，20000 g離心10 min，將上清輕輕倒人至另一個干凈的離心管中，如果有可見的漂浮物可用數層紗布過濾。

9.  加人0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5~10 min。

10.  室溫，15000 g離心10 min。棄上清，加人2 ml 70%乙醇輕輕洗滌沉淀。

11.  室溫，15000 g短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥。4 °C無限期保存。

1.  為提髙產量，應采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度；振搖速度大于400 r/min。

2.  如果DNA要用層析法純化，加人50 μg/ml RNA酶A以降解RNA。