質譜成像技術從實驗臺到臨床

　　“人類天生就可以收集大量的視覺信息。”范德堡大學醫學院斯坦福·摩爾生物化學主任與質譜研究中心主任Richard Caprioli表示，“我們喜歡圖樣、我們喜歡照片，我們通過一張簡單的照片可以獲得大量的信息。”

　　在Caprioli看來，這一點解釋了質譜成像技術(MSI)為什么越來越受歡迎。尤其是這項技術可以幫助組織學家獲得原本需要數年才能掌握的專業知識。“它采用的不是顏色維度，而是分子維度。但這個事實并不是那么重要，只要分子維度有足夠的信息量。”他說。

　　質譜成像技術就像是免疫組織化學的高通量版本，只是沒有抗體而已。質譜成像技術并沒有為組織切片事先染上特殊標記，它使用質譜儀一次性挑選并繪制成百上千種分子的空間排列。研究者無需提前知道哪個分子比較重要，就可以利用該技術進行繪制挑選，而且速度很快。“我們的儀器有激光，每秒可以做5000個質譜。”Caprioli表示，這一速度足以在一個小時之內掃描包括數百個病患活組織在內的組織微陣列整體。

　　但是，質譜成像技術的應用也存在明顯的障礙。比方說，圖像分辨率隨著光點尺寸的減小而升高，但卻降低了離子材料的產量。該技術并沒有初步分離的步驟，因此可能會只抽取豐度最高的分子。而在計算方面，研究人員面臨的挑戰則是如何對數據進行分析，特別是如何能夠真正理解這些數據。但是不管怎么說，研究人員正在使用質譜成像技術進行研究，無論是確定亞細胞分辨率下組織切片中的藥物代謝產物，證實疾病的生物標記，還是鑒別腫瘤的邊界等等。他們甚至正在將該技術引入臨床，至少是接近于臨床研究。

　　質譜成像技術的策略

　　那么，什么是質譜成像技術?就像是一張標準的數碼照片，數字成像的色彩是通過紅綠藍3個顏色通道疊加而成的，屏幕上每個小像素的顏色都是由這三個顏色的密度所構成的。

　　現在，想象一張擁有成千上萬個顏色通道的圖片。這就是質譜成像技術，Caprioli說，每個通道都是你想要展示的那個分子種類或質譜峰。研究人員將這些不同的通道互相覆蓋，便可以產生一個針對組織分子構成和空間分布的彩色繪圖，無論是對蛋白質、神經肽、代謝分子還是脂類等組織——顯然脂類的需求正在增加。

　　研究人員為質譜成像技術設計了幾十套方案，但正如2012年的綜述中所說的(J. Proteomics, 75:4883, 2012)，只有三種是最常見的。Caprioli的基質輔助激光解析質譜成像技術(MALDI-MSI)通過紫外線激光光柵掃描一個基質包膜的組織切片來建立圖像。該技術的像素大小一般近似于1到10個微米，意味著它可以達到亞細胞分辨率。但由于它需要使用MALDI基質和真空環境，所以MALDI- MSI不適用于活體樣本。同時，基質是用來吸收激光能量并轉移到樣本上去，但是這種基質可能會很難在樣本上操作并產生大量的小分子量的電離物，這會遮蔽生成光譜的代謝區域。

　　賓夕法尼亞州立大學埃文·普名譽化學教授Nick Winograd采用了第二種方法——次級離子質譜法(SIMS)。這種方法通過在樣品表面噴鍍離子束讓樣品產生電離作用(比方說，英國 Ionoptika公司的帶電C60分子或氬團簇束)，不使用激光。Winograd稱，這種方法有兩大優點，第一個是分辨率：SIMS得出的像素約有 300納米，而MALDI充其量只有1毫米。另一個是通過分子深度剖析，研究人員可以使用碰撞而成的坑痕去“深挖”這個樣本，通過三維立體化繪制其分子組成物。

　　第三種是電噴霧解析電離技術(DESI)，這種(非真空的)電離技術通過噴射溶劑，將溶劑覆蓋在未經處理的組織表面上，溶解表面的分子。然后再繼續往上滴溶劑，以使溶解物濺到質譜儀上，進行電離和分析。(Prosolia公司對DESI技術進行商業化，該公司由該技術的發明者、普度大學化學家R. Graham Cooks共同創辦。)

　　DESI、MALDI、SIMS這三種技術以及他們的變體都采用阿姆斯特丹FOM研究所AMOLF學院Ron Heeren所謂的“微探針”模式，分辨率隨著像素尺寸減小而升高。這里面的問題是如何從盡可能小的光點中最大化樣品的電離作用。但是較小的光電也就意味著檢測到的離子會更少，且不要說成像時間會更長了(因為里面的像素會變多)。

　　Heeren更喜歡“顯微”模式。這種模式可以用散焦像素更快成像，再加上像素檢測器如CCD，可以有效地一次性捕獲262144(512x512)個光譜。

　　“這就像個相機。”Heeren解釋道，“就是一點，我們制造的是分子閃光照片。”

　　Heeren認為這個“質譜顯微鏡” 的關鍵是Timepix探測器，這個探測器是CCD和飛行時間質譜分析器的結合。(Heeren共同創立的Omics2Image擁有Timepix探測器)。他解釋，大多數質譜檢測裝置將探測器視為一個大的像素，將所有到達表面的離子碰撞整合為一個單一的信號。Timepix將這個信號分成262000 個空間分辨的點，這樣在探測到成像表面分子時，它們可以保持并記錄自己的空間定位，成像速度非常快。

　　有多快?Heeren說，MALDI-MSI儀器可以產生每秒鐘一個像素，達到一微米的分辨率。因此在一個100x100毫米的區域中，要想生成1萬個像素需要花費2.7個小時。但使用質量顯微鏡和Timepix探測器，“我們可以在一秒鐘內得到這些信息。”

　　顯微鏡上還有物理電子學TRIFT SIMS-TOF系統，上面還有一個MALDI技術，Heeren團隊最近正在使用這一技術探索骨關節炎下的生理變化。“我們甚至可以證實，在蛋白質水平和脂代謝水平上的生理變化以及軟骨礦化，會導致軟骨機械強度的流失。”他說。

　　常態MSI

　　與MALDI和SIMS相比，DESI和激光燒蝕電噴霧技術(LAESI，由Protea Biosciences推出的激光技術)這些正常大氣壓下的電離技術擁有一些特殊的優勢。最明顯的優勢是，他們不需要進行樣品處理，在正常空氣中操作即可，不需要真空。因此，他們可以用在活體樣本上，甚至可以在患者身上進行操作。

　　“我自己這輩子的追求就是：用未處理過的樣品就可以進行質譜分析。”這是Cooks幾十年來的目標。

　　作為一個研究者，Cooks的工作是提取并測定植物生物堿的結構。很長的一段時間內，研究都非常艱辛，他只提取了一點“不純的生物堿，而且也沒有做出結構方面的進展”。直到他遇到了從斯坦福大學來演講的Carl Djerassi。他說，Djerassi把他的材料樣品帶回了實驗室，并收集它們的質譜，十天后又把結構發了回來。“這讓我相信質譜分析法的強大。”Cooks說，“同時，我也發現提取方法學中存在的局限性。”

　　從那以后，他開始從那些在生物上不怎么好操作的技術限制中脫出來，進行質譜分析，發展了正常氣壓下的電離技術，特別是DESI。2011年，由Cooks和哈佛醫學院Nathalie Agar共同領導的團隊，使用電噴霧解析電離質譜技術(DESI-MS)來存儲腦腫瘤組織，使用脂類特征檢測結果幫助電腦區分不同形式和組織病理學分級的神經膠質瘤(一種腦瘤)。

　　對于這種分析來說，脂類是一個古怪的選擇。的確，脂類對于MSI從業者來說就是無奈之舉，但他們必須從中獲取最大的價值。在標準的細胞分析中，研究人員可以分離細胞提取物，并去掉不想要的部分，這其中往往就包括脂類。但是在MSI及其他原位應用中，研究人員必須知道自己面前擺著的是什么。他們面前擺著的主要是脂類。但幸運的是，脂類不僅豐度高，非常容易電離，而且信息量也很大。

　　“如果你只看脂類的話，它的組織特征比蛋白質要好得多。”倫敦帝國學院醫療質譜部門研究員Zoltán Takáts這樣說。

　　最近，Cooks和Agar將這一方法應用到5個正在進行治療的腦癌病人的32個手術標本當中。該系統通過逐個像素報告了腫瘤的亞型、分級以及癌細胞的部分。Cooks說，這些數據可以讓他們的團隊在繪制腫瘤邊界時找出不同組織病理學級別的各個區域，補充MRI數據。他還強調，他們使用的是“最便宜的”質譜分析儀器，Thermo Fisher公司的單級(與串聯相對)低分辨率LTQ離子阱。

　　但Agar也指出，這還是一個研究項目，團隊不能實時將這些結果傳遞給外科醫生，他們在波士頓收集樣本，但真正成像卻是在印第安納州。自那以后，她的團隊在布萊罕婦女醫院的AMIGO手術室安裝了Bruker公司利用DESI技術的amaZon Speed離子阱，用來進行腦瘤案例的測試。該手術室是醫院的影像引導治療國家中心。Agar說，很快他們會研制出乳腺癌測試，但是團隊仍然不能指導外科醫生真正操刀。這種方法首先必須經過驗證，“這最終會需要經過臨床試驗進行驗證。”

　　簡化數據分析

　　最終，要想把MSI推向臨床，就必須要跨越質譜儀專家，讓真正需要使用它的人掌握這門技術。然而，沒有幾個臨床醫生能夠掌握MSI技術、數據處理和信息學的精妙，而且更沒有人愿意花時間學習了。在Cooks看來，如果這項技術“又嬌貴，而且這項質譜技術需要博士才能掌握”的話，就很難進行推廣，“它需要全自動，儀器也不能那么嬌貴，必須要可靠而且相對簡單。”

　　對于典型的組織病理學應用來說，這不是什么問題，因為這個系統可以配置成智能盒子(turnkey boxes)，只有通過特定的生物標記才能打開。全球的各大臨床實驗室已經在常規地使用非成像質譜儀，包括Bruker公司的MALDI BioTyper和Sequenom公司MassARRAY。Caprioli想要為組織學家和病理學家設計一款類似于顯微鏡的MSI，儀器小到甚至可以塞在桌下。實驗室技術員只需要學會如何準備樣本、操作機器，軟件就可以進行剩下的操作。

　　但是像生物標志物鑒定等更為復雜的應用則是另一回事兒。“質譜成像技術數據集的大小取決于圖像像素的數量和質譜儀的分辨率。而近年來，它倆發生了巨大的變化。”勞倫斯-伯克利國家實驗室科學家Ben Bowen說，他發明了質譜成像技術的數據分析軟件。

　　隨著分辨率的提高，像素就會收縮。同時，進行“發現模式”實驗的研究人員預先不知道哪個分子更為重要，所以他們要將所有分子都考慮進去，在成千上萬個顏色通道上進行兩兩比較。

　　所有這些像素加起來的數據是驚人的。 Bowen說，他的同事Trent Northen在自己的工作中使用質譜成像技術，這些年已經收集了幾百萬兆字節的數據。對于初學者來說，打開數據文件都是個問題，這讓他們非常依賴更精通于這項技術的專家。“你就會知道為什么它讓這些科學家如此不悅了。”Bowen說。

　　為了減輕他們的負擔，Northen 和Bowen與伯克利實驗室數據可視化專家Oliver Ruebel一同研發了OpenMSI的云計算平臺，用戶可以直接在瀏覽器上瀏覽和操作質譜成像技術的云計算數據。Bowen介紹，美國能源部國家能源研究科學計算機中心(NERSC)的超級計算機用于支持該系統，將數據處理時間從幾天減少到幾分鐘。

　　Bowen說，他和Northen的合作者之一可以使用OpenMSI詳細研究50千兆字節的數據集，這個數據集他在一年半前就收集到了，但是一直沒有辦法進行研究。“現在他就在(谷歌)瀏覽器中使用這項技術。”他舉例說，包括瀏覽RGB圖像，檢驗下面的光譜，并與同事分享數據，“所有你能想到的21世紀互聯網所提供的功能，我們都能在 OpenMSI上實現質譜成像技術的這一功能。”

　　手術室的質譜儀

　　但是要想達到臨床可譯性的最優化，研究人員可能必須要脫離MSI的成像部分。這就是倫敦帝國學院Takáts的研究成果。

　　Takáts是Cooks之前的博士后，作為論文第一作者首次對DESI進行描述。他研發并正在檢測一種新的非真空電離技術——快速蒸氣電離質譜儀(REIMS)，并設計了iKnife智能手術刀，外科醫生可以在手術室就搞定組織的組織學和組織病理學問題。

　　“最終的設備非常簡單。”Takáts解釋道，而且還依賴電外科技術，這種切割技術使用電流氣化組織。這個過程釋放的煙霧是焦油、微粒物質和電離脂質的組合，iKnife持續提取樣本放入附在旁邊的聚四氟乙烯管，然后放入質譜儀。

　　在過去幾年內，Takáts建立的數據庫包括了近20萬人類癌癥和健康組織的脂類樣本。通過這些數據，他證實了可以通過脂類生物標記區別不同的樣本。因此，使用在電外科過程中產生的離子化的脂類特征，他的系統可以基本上實時地確定iKnife下面的組織是健康的還是癌變的，以及其組織學狀態。

　　但要說明的是，這里面沒有成像。“出來的診斷結果是組織學水平的鑒定。”Takáts說，“這個系統會告訴你這是非小細胞肺癌，2期之類的。”

　　在匈牙利、德國和英國，iKnife(MediMass公司和帝國學院的研發成果)已經在超過500個手術中進行檢測，“在絕大多數案例中，能夠達到100%的分類正確率。”Takáts說，涵蓋了胃腸道癌、肝癌、肺癌、乳腺癌和腦癌。在有些案例中，醫生本以為是腫瘤，但是該技術卻證明只是良性組織或炎癥性疾病。現在，Takáts正在研發一種新的系統，可以為內窺鏡檢查進行類似的評估。

　　Takáts表示，最終，這種應用可能會讓MSI變得“意義非凡”，不僅是作為一個研究工具，更是作為常規的臨床技術。他指出，組織病理學研究者可能不愿意接受這種相對較慢、而且價格高昂的技術。但他也表示，是這款儀器的速度和價格都會有所改善。以往，要想進行這項檢測，最好的時機是要在解剖后等待半個小時才能進行檢測。如果這項技術能夠醫生在幾秒鐘內提供診斷，并且是體內的，那么人們就會更傾向于這項技術。

　　“這套系統的優勢是組織病理學所不能及的。”他說。