質譜檢測法與蛋白質分析（三）

　　Protein(s)：待測蛋白質樣品;Enz. Digestion：酶解;Pep. Mixture：裂解產物混合物;

　　MS Analysis：質譜檢測分析;DB Search：數據庫比對搜索;Identities：鑒定;

　　Prot.DB ：蛋白質數據庫;Proteome：蛋白質組;Sample prep：樣品準備(裂解);

　　LC/MS& MS/MS：LC/MS以及 MS/MS分析;Quantification：定量研究;

　　Abundances：豐度;List of targets：挑選出待測樣品;Pep.lib：待測靶樣品;

　　圖 2 蛋白質組學研究策略示意圖。 A ：經由 2 維電泳或 pull-down 實驗發現的待測蛋白質樣品 prot 隨即被酶解，然后用質譜儀對酶解片段 pep 進行質譜檢測分析。最后根據肽質指紋圖譜( PMF )鑒定出肽段以及它們的來源蛋白。其它的 MS/MS 數據也能用來進行肽段鑒定。 B ：隨機蛋白質鑒定和定量分析方法，即鳥槍法。該方法可以對樣品同時進行鑒定以及定量研究。被選出的肽段如圖 1A 中所示，經過串聯質譜儀進行離子掃描分析。在這里，母離子是被隨機選出的，通常母離子的裂解片段中只有一個片段能夠被檢測到，也就是說存在采樣不足的問題。 MS1 質譜儀采集到的離子強度信息與參考分子信息比對可以進行定量分析，這里使用的參考分子通常都會標記上穩定的同位素標簽。 C ：定量研究方法能去除蛋白質定量研究與鑒定過程中的干擾信號。首先， MS1 質譜儀會通過比對不同樣品的肽模式，即肽段分子量相對色譜保留時間作圖的結果，挑選出不同樣品間豐度不同的肽段。然后被挑出的肽段進入下一輪 MS/MS 質譜檢測。 D ：基于各種假說的檢測方法。該方法可以對各種預先被設定肽段的豐度進行高精度的檢測，我們通常都是根據以往的實驗結果來挑選這些靶肽段。在這里常用的方法是圖 1D 中所示的 MRM 方法。如果在試驗中選用合適的參考肽段會進一步提高實驗的準確性。

　　比較模式分析

　　圖2C中所示的比較模式分析法其實在原理上與2維電泳方法是相似的，就像在2維電泳中一樣，每一個蛋白質都是一個獨立的點，可以借此對它們進行定量和定性的分析。而且還可以進一步對蛋白質進行分析，比如進行蛋白質測序或進行翻譯后修飾情況鑒定等。不過在以質譜檢測手段為基礎的分析方法中，蛋白質樣品首先需要被降解、片段化，然后再用液相色譜-質譜儀LC/MS進行分析。借助色譜洗脫時間和分子量這兩個參數，我們就可以鑒定出一個多肽離子。將所有離子的數量信息整合起來就得到了蛋白質的定量信息。這種方法主要的優勢在于它可以對質譜儀發現的所有信息進行定量處理。與“鳥槍法”相比這是非常明顯的優勢，因為在“鳥槍法”里，只能對被鑒定出來的肽段進行定量化處理。不過在實際運用過程中，這種比較模式分析方法的重復性很差，也沒有非常好的配套軟件對檢測結果進行分析。用這種方法可以獲得一些數據，根據這些數據能夠推測出蛋白質序列，這些數據包括質荷比(m/z)、帶電荷狀態、洗脫時間以及離子強度等。需要被測序的多肽(比如在兩個樣品中表達豐度不同的同一蛋白質)會出現在檢測結果列表中，然后，我們會將該蛋白(多肽)進行新一輪的直接質譜檢測，專門只采集它的MS/MS質譜圖信息。這種研究方法也可用于MALDI/MS/MS質譜檢測平臺，因為蛋白質樣品都被“固定”在樣品板上，因此可以對它們進行不受時間限制的連續檢測。

　　基于各種假說的研究策略

　　隨著各種質譜儀技術的不斷進步，我們有理由相信會出現敏感度更高、處理速度更快、更可靠的蛋白質組研究設備。不過目前我們還不清楚這些技術上的進步是否足以突破當下蛋白質組學研究工作中的瓶頸。以前我們曾認為蛋白質組學研究策略需要進行有效的變革才能全面、有力的對蛋白質組進行研究和分析。這種變革的核心就是改變以往那種在每一次試驗中都對既往結果進行重復研究的蛋白質組學研究方法，新的研究策略是根據既往的研究成果來設計、指導進行新的實驗研究項目。我們預計與人類基因組計劃一樣，將來也會獲得某個物種的完整蛋白質組序列圖譜，未來蛋白質組的研究目標應該是對蛋白質(多肽)進行具有特定目的的、非冗余的分析研究。對于質譜技術和質譜儀器的發展來說，這種研究策略的轉變需要有更好的檢測設備和檢測手段(流程)做依托，要能夠以更快的速度、更高的靈敏度和更強大的分析能力進行質譜檢測。現在也出現了可供序列組裝、修飾情況查詢的數據庫。可以預計，在不久的將來，各種生物學假說將會給我們設定出許多待檢測的蛋白質靶標。我們可以將這些蛋白質的信息錄入數據庫，構成一個檢測這些假說所必需的極小集蛋白質信息簇。然后，可以用各種方法，比如MRM方法對這些蛋白質進行檢測(圖2D)。因為這種研究方法主要是對非冗余靶標進行質譜檢測，所以，在檢測的敏感度方面和樣品處理能力方面都有很大的提高。如果再配合定量的、標準化的同位素標記參考肽段，還可以進行精確的定量分析。

　　上述這種研究策略最適合用于Q-Q-LIT質譜儀這類被我們使用了幾十年，主要用于檢測小分子藥品和體內藥物代謝研究領域的三重四級桿質譜儀。在研究藥物代謝時使用的研究方法同樣適用于蛋白質組學研究領域。

　　作為上述方法的一個補充，Smith又開發出另一種使用精確分子量標簽來鑒定蛋白質的方法。該方法首先測定待測物質的分子量，然后將數據與分子量數據庫進行比對，以此來鑒定蛋白質。這樣就無需再對每一個樣品中的每一條多肽進行測序了。隨著蛋白質組學研究的不斷開展，我們積累的數據也越來越多，并且數據積累的速度也越來越快，同時，各種分析軟件的功能也越來越強大，因此我們相信，基于各種假說的蛋白質組學研究策略一定會被更多的人所接受，所采用。

　　Labeling：標記 Tag：標記物 Peptide：肽段 Mixing：混合 Analysis：分析

　　MS：質譜檢測 light：較輕的片段 heavy：較重的片段 Time：時間

　　Tandem mass tag：串聯標簽 MS/MS：MS/MS模式 m/z：質荷比

　　No labeling!：為標記 MRM：MRM方法

　　Internal standards(isotopically labeled peptides)：內參，即同位素標記的肽段

　　圖 3 肽段定量分析策略示意圖。 A ：同位素稀釋法是進行肽段定量分析時最常用的一種方法，該方法也是進行蛋白質組學研究時常用的一個方法。該方法的原理是在一號樣品所有的待測蛋白質上都帶上一個穩定的同位素標簽，同時在二號樣品所有的待測蛋白質上都帶上另一個穩定的同位素標簽。這樣，這兩組樣品就可以互為參照了。可以借助化學的方法，例如穩定的同位素編碼標簽試劑、代謝標記反應和酶標反應等對蛋白質進行同位素標記。 B ：使用串聯標簽進行定量研究。該方法同樣需要各種穩定的同位素標記物。這些同位素標記物由兩種同位素標記元素組成，它們都有固定的分子量。目前，這些試劑可用于四通道反應。通過在質譜儀的 MS/MS 模式下檢測連接在蛋白質 N 端報告基團的相對強度以及 CID 圖譜中低分子量范圍里的信號可以獲得待測蛋白質的定量信息。 C ：使用內參進行定量研究的方法。該方法實際上也是一種同位素稀釋法。在該方法中會往待測樣品中添加一種已知濃度的同位素標記的肽段，然后借助標準曲線進行精確的定量分析。雖然該方法樣品制備過程較為復雜，但是它的前景非常光明。它非常適合用于基于各種假說的檢測方法。

　　結論與展望

　　在過去的十年里，是蛋白質分析，更準確的說應該是蛋白質組學分析推動了質譜檢測技術的發展。各種技術進步已經使質譜儀在準確度、分辨力、敏感度、定量分析能力等各方面都有了長足的進展，蛋白質組質譜檢測策略方面也有了新突破。分析完整蛋白質、蛋白質復合體、低豐度蛋白質等各種樣品的檢測操作流程層出不窮。雖然這些質譜檢測技術是為了滿足蛋白質分析的需求而誕生的，但是它們出現之后又反過來推動了生物大分子(包括代謝產物、脂類物質、碳水化合物等等)領域的研究。因此，我們有理由相信，質譜檢測技術必將在生物研究的各個領域里占有重要的一席之地。