轉基因植物的分子檢測與鑒定方法（二）

發布時間：2020-06-15 15:25 原文鏈接：轉基因植物的分子檢測與鑒定方法（二）

1.1.2.2 降落PCR

TD-PCR是一種在一個反應管或少數幾個反應管中通過一系列退火溫度逐漸降低的反應循環來達到最佳擴增目的基因的PCR方案。它通過體系自身的代償功能彌補以反應體系和并非完美的循環參數所造成的不足。此策略保證了最初形成的引物模板雜交體具最強的特異性。盡管最后一些循環采用的退火溫度會降到非特異的Tm值，但此時的擴增產物已開始幾何擴增，在余下的循環中處于超過任何非特異性PCR產物的地位，從而使PCR產物仍然呈現出特異性擴增。 R.H.Don等認為，PCR過程中的前幾個循環對于擴增產物的純度非常重要，因此前幾個循環較高的退火溫度，會增加引物與模板結合的特異性，TD-PCR方法可以阻止非特異性產物的形成。由于TD-PCR的策略是在較早的循環中避免低Tm值配對，故在TD-PCR中必須采用熱啟動技術。

1.1.2.3 rpPCR

由于外源基因整合到目標基因組時常發生重排，因此Southern雜交并不能清楚地分析轉基因的拷貝數和整合情況。Kumar和Fladung在研究轉基因楊樹的外源基因整合行為時發明了rpPCR方法。這種方法就是利用不同的引物進行配對，對基因組DNA擴增，根據不同的引物對的擴增情況及產物的大小來推定 T-DNA的拷貝數、整合情況及拷貝的完整性等信息。與Southern雜交相比，該法的優點在于能比較方便快捷地指出重復單位是否完整，并能表明這種重復的方向。此方法的不足之處是在有多拷貝整合在不同的染色體上時不能顯示作用。

1.1.2.4 反向PCR

IPCR與普通PCR相同之處是都有一個已知序列的DNA片段，引物都分別與已知片段的兩末端互補。不同的是對該已知片段來說，普通PCR兩引物的3’--末端是相對的，而IPCR則是相互反向的。因而 IPCR可以擴增已知序列片段旁側的未知序列。根據這一特點，可以對外源基因在植物基因組中整合的拷貝數進行分析，多拷貝多位點整合時，擴增產物在電泳圖譜上呈現多條帶，單拷貝時只得到一條帶。

然而，該技術要求DNA模板復雜度低于109bp，如果高于此值，則不能獲得理想的效果。另外，自連接(環化)的效率也是限制該技術成功的因素。

1.1.2.5 實時定量PCR

實時定量PCR是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。其特點是：特異性好，實時定量PCR技術通過引物或和探針的特異性雜交對模板進行鑒別，具有很高的準確性，假陽性低；靈敏度高，采用靈敏的熒光檢測系統對熒光信號進行實時監控；線性關系好，由于熒光信號的強弱與模板擴增產物的對數呈線性關系，通過熒光信號的檢測對樣品初始模板濃度進行定量，誤差小；操作簡單，自動化程度高，實時定量PCR技術對PCR產物的擴增和檢測在閉管的情況下一步完成，不需要開蓋，交叉污染和污染環境機會少；沒有后處理，不用雜交、電泳、拍照。

1.2 Southern雜交

Southern雜交是利用經過標記的DNA、RNA探針與靶DNA進行特異性雜交，分析外源基因在植物染色體上的整合情況(如拷貝數、插入方式)以及外源基因在轉基因后代的穩定性問題。Southern雜交可以不受操作過程中的DNA污染影響和清除轉化中的質粒殘留所引起的假陽性信號，準確度高，特異性強，是研究轉基因植株外源基因整合最可靠的方法。已廣泛應用于水稻、小麥、玉米、大豆、油菜、桃等各類作物轉基因植株的檢測。然而該方法程序復雜，成本高，且對實驗技術條件要求較高，使其使用受到了限制。

2 外源基因在轉化植株中是否轉錄的檢測與鑒定

2.1 Northern雜交

外源基因在轉化植株中的轉錄水平可以通過細胞總RNA和mRNA與探針雜交來分析，稱為Northern雜交，它是研究轉基因植株中外源基因表達及調控的重要手段。Northern雜交程序一般分為三個部分：植物細胞總RNA的提取探針的制備印跡及雜交。Northern雜交比Southern雜交更接近于目的性狀的表現，因此更有現實意義。但Northern雜交的靈敏度有限，對細胞中低豐度的mRNA檢出率較低。因此在實際工作中更多的是利用RT-PCR(reverse transcription PCR)技術對外源基因的轉錄水平進行檢測。

2.2 RT-PCR

RT-PCR的原理是在反轉錄酶作用下，以待檢植株的mRNA合成cDNA，再以cDNA為模板擴增出特異的DNA。因此，RT-PCR可在mRNA水平上檢測目的基因是否表達。RT-PCR十分靈敏，能夠檢測出低豐度的mRNA，特別是在外源基因以單拷貝方式整合時，其mRNA的檢出常用RT-PCR。

Samia Djennane等把煙草硝酸還原酶基因Nia2經農桿菌介導導入馬鈴薯，經RT-PCR分析，Nia2基因在轉基因馬鈴薯體內RNA水平得到表達。

由于RT-PCR是在總RNA或mRNA水平上操作，檢測過程中必須注意RNA的降解和DNA的污染，另外還要設置嚴格的對照來防止假性結果的出現。