一、網狀細胞和紅細胞胞質液的制備
1. 自動物身上采血，每 7 ml 血加 1 ml 酸-檸檬酸鹽-葡萄糖溶液（ACD；75 mmol/L 檸檬酸三鈉，38 mmol/L 檸檬酸，136 mmol/L 葡萄糖，pH 5.0)。
2. 室溫 500 g 離心 10 分鐘收集網狀細胞和紅細胞。吸出血漿和白細胞層。
3. 用 1~2 倍體積的 2% 明膠（Sigma) /PBS溶液（預熱至 37℃）懸浮細胞，37℃ 水浴靜置至少 30 分鐘。
4. 吸出上層含血小板和白細胞部分，用 PBS 在 1600 g 離心清洗細胞，盡可能多的吸出上清。
5. 加入 2 倍體積的裂解緩沖液裂解細胞，冰浴 20 分鐘。
裂解緩沖液：
0.75 mmol/L 乙酸鎂
0.15 mmol/L EGTA
3 mmol/L DTT
蛋白酶抑制劑
6. 裂解液用超速離心機，4℃，100000 g 離心 30 分鐘。
7. 收集上清，避免下層混濁的紅細胞影部分。加入1/10 體積的 10x 轉運緩沖液。
10x 轉運緩沖液：
200 mmol/L HEPES，pH 7.3
1.1 mol/L 乙酸鉀
20 mmol/L 乙酸鎂
8. 分成小份裝入微量離心管中，在液氮中冷凍，-80℃ 或液氮中保存。
二、用培養細胞制備胞質液
1. 500 g 離心 5 分鐘收集細胞。
2. 用 PBS 在 500 g 離心 5 分鐘清洗細胞兩次。
3. 像網織紅細胞的第 5 步那樣，在冰上用 2 倍體積的裂解緩沖液中溶脹細胞 20 分鐘。
4. 用一緊密吻合的金屬或玻璃 Dounce 勻漿器研磨 10 次以裂解細胞。
5. 4℃，10000 g 離心 10 分鐘去除細胞碎片。
6. 收集上清，按上面講的網織紅細胞的第 6 到 8 步那樣處理。
三、用組織制備胞質液
1. 自新處死的動物中采集組織，用 PBS 清洗。
2. 用剃刀片將組織切成小碎塊，與上文的裂解緩沖液一起加入預冷的 Dounce 勻漿器中。
3. 按上面的細胞操作步驟的 4~6 步那樣處理。
四、用卵母細胞制備胞質液
1. 自麻醉的動物中取出卵巢，放入 PBS 中。
2. 去除粘連的其他組織，吸走多余的 PBS，放進預冷的 Dounce 勻漿器中。
3. 加入 1 倍體積的轉運緩沖液，用松散吻合的研杵溫和地研磨兩次使之裂解。
10x 轉運緩沖液：
200 mmoI/L HEPES，pH 7.3
1.1 mol/L 乙酸鉀
20 mmol/L 乙酸鎂
4. 4℃，2000 g 離心 10 分鐘，用一巴斯德吸管移走上清。
5. 4℃，100000 g 離心 30 分鐘，收集上清，仍然要注意不要碰上下兩層。
6. 用轉運緩沖液稀釋，按上面說的方法冷凍。 展開 | 