近紅外熒光探針（IRBNHS）檢測試劑盒使用常見問題解答

1. 投量一般是按摩爾數比來算的，大概是需要接入氨基的個數的2倍投量。用這個方法換算的話，因為不知道 IRB-NHS 里面含有幾個活性酯，所以具體的量無法確定。
   

答復：每個IRB-NHS中只有一個活性酯，但由于IRB-NHS本身水解作用，其投料比往往控制在伯氨基的1.5-2.0倍左右。

2.標記抗體時，抗體與染料的投料比是多少？

答復：是1:3（摩爾比），大概每個抗體上可以標記1個左右熒光基團。

3.想用這個染料修飾的材料的分子結構式中含有氨基（伯胺）和羧基，有兩個問題：

1)羧基會不會參與反應？如果會的話我需要如何處理？

答復：羧基不會參加反應，IRB-NHS只與待標記材料中的伯氨基反應生成穩定的酰胺鍵。

2)這種染料在與伯胺反應后，水溶性如何，還會有何種水溶性基團。

答復：熒光基團本身含兩個磺酸基，其水溶性很好，不會現在改變所標記材料的水溶性。

4.該染料的分子結構信息，可否提供？

答復：母核是花菁類染料，可以提供其基本結構。

5.關于“配制的DMF稀釋液需立即使用。存放導致活性迅速喪失”這個說明，染料標記上靶分子以后，熒光可以持續多久？

答復：活性喪失主要是指活性NHS酯基基團破壞，無法與待標記材料商氨基鍵合，并非指熒光信號本身消失。連接上目標材料后，低溫避光保存，固體狀態熒光可以維持數月，液體狀態數周。

6.有一個實驗方案如下：標記的是一個多肽，共61個氨基酸，大小為6.6KD。

1)多肽溶于無菌PBS中，終濃度為10 mg/ml。

2)將0.2mg IRB-NHS 粉末配置成  DMSO 溶液( 0.01 mg/uL)。

3)將配置好的20ul染料立即逐滴分別滴加至200ul 10mg/ml 多肽溶液中，至于搖床，室溫反應2 h。

4)反應結束后，反應液加入超濾管中進行超濾（ 4000 rpm，30×3min ）取超濾管上層溶液。

5)尾靜脈注射SCID小鼠，100ul IRB-NHS -V5/mice

請問這個方案合理嗎？

答復：該方案基本合理。反應環境pH可以控制在7.4-8.3之間。IRB-NHS使用量（摩爾數）應為根據每條多肽期望的熒光基團個數的兩倍量。另要確保多肽上有足夠的伯胺基可以與NHS活性酯反應。另外，盡量避免多肽上功能區域的胺基與熒光基團反應從而影響多肽活性。反應結束后，建議純化后觀察材料顏色。成功標記后的材料應該呈深綠色。

7.抗腫瘤抗體，190KD，想做近紅外靶向成像實驗，抗體和染料的比例是多少？在尾靜脈100ul情況下打入的抗體應該控制到多少摩爾，多少質量會有比較好的成像效果？感覺最重要的環節就是比例和用量，不然小分子多的話靶向性真的體現不好，其他代謝部位都有擴散。

答復：一般每個抗體上標記2-5個近紅外熒光分子就能夠很好進行成像。抗體注射劑量與診斷和治療目標有關，有很多文獻可以查到！標記到抗體上的熒光基團由于數量很少，不會對抗體靶向性產生影響！

8.激發波長對實驗結果影響多大？有的儀器沒有789nm的波長？

答復：最佳條件是在探針最大吸收處激發，但在730-780 nm處激發都有較強信號！ 

9.感覺這個固體粉末是不時間稍久就會沾到管壁上，上次做的時候，用的是實驗室師兄以前買的，但都沾到了管壁上，不能夠實際稱量，我就用DMSO溶解了，但感覺比例就加的不對了，染料可能加多了，胃腸處的熒光強度太強，都曝紅曝白了

答復：活體注射是要摸索劑量的。該探針由于含有NHS基團，不宜長期存放，建議購買后3個月內使用！不能配成溶液后存放!

10.在染料和抗體偶聯完后，三次超濾后仍見超濾下來的液體是綠色，是否為染料加入過多？是否要超濾到無色為止？

答復：最好超濾液中不要有明顯綠色！但也有可能是濾膜不好導致抗體濾出導致顏色。

11.如果多肽分子量太小，1.5KD 用什么純化方法比較好？可以用HPLC純化嗎？

答復：一般利用層析柱分析。根據分子量差異進行分離。探針分子量為800，所以很容易進行分離。

12.多肽是1400，不好分啊？cy5.5可以用HPLC不知道你們的這個可以不？HPLC對偶聯后的多肽和IR影響大嗎？

答復：1400和標記熒光基團后的2200還是可以用層析住分的。分子量還是差別較大的。也可以用HPLC分。不過更耗時一些。

13.1.4KD的多肽和IR783耦連后，如何把多余的IR783去除掉？具體一點的方法。

答復：利用標記前后分子量不同可以通過柱層析分離。