進口PCR儀的常見問題詳細解答

　　1. 進口PCR儀cDNA產量的很低

　　可能的原因：

　　*RNA模板質量低

　　*對mRNA濃度估計過高

　　*反應體系中存在反轉錄酶抑制劑或反轉錄酶量不足

　　*同位素磷32過期

　　*反應體積過大，不應超過50μl

　　2. 進口PCR儀擴增產物在電泳分析時沒有條帶或條帶很淺

　　*zui常見的原因在于您的反應體系是進口PCR儀的反應體系而不是RT-進口PCR儀的反應體系

　　*與反應起始時RNA的總量及純度有關

　　*建議在試驗中加入對照RNA

　　**鏈的反應產物在進行進口PCR儀擴增時，在總的反應體系中的含量不要超過1/10

　　*建議用Oligo(dT)或隨機引物代替基因特異性引物（GSP）用于*鏈合成。由于RNA模板存在二級結構，如環狀結果，有可能導致GSP無法與模板退火；或SSⅡ反轉錄酶無法從此引物進行有效延伸。

　　*目的mRNA中含有強的轉錄中止位點，可以試用以下方法解決：

　　a. 將*鏈的反應溫度提高至50℃。

　　b. 使用隨機六聚體代替Oligo(dT)進行*鏈反應。

　　3. 產生非特異性條帶

　　*用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的進口PCR儀結果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。

　　*在進口PCR儀反應中，非特異的起始擴增將導致產生非特異性結果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結果的產生。

　　*由于mRNA剪切方式的不同，根據選擇引物的不同將導致產生不同的RT-進口PCR儀結果。

　　4. 產生彌散（smear）條帶

　　*在進口PCR儀反應體系中*鏈產物的含量過高

　　*減少引物的用量

　　*優化進口PCR儀反應條件/減少進口PCR儀的循環次數

　　*在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時，其產生的寡核苷酸片段會產生非特異性擴增，一般會顯示為彌散背景。

　　5. 進口PCR儀產生大分子量的彌散條帶

　　*大多數情況下是由于退火溫度過低而導致的非特異性的起始及延伸產生的

　　*對于長片段的進口PCR儀，建議將反應體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）

　　6. 在無反轉錄酶的情況下，對照RNA獲得擴增結果

　　*通常是由于對照RNA中含有痕量DNA而導致的。由于進行體外轉錄時不可能將所有的DNA模板消除。建議可將*鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。

　　*有可能是引物二聚體的條帶

　　7. 進口PCR儀擴增產物滯留在加樣孔中

　　*有可能是由于模板量過高而導致進口PCR儀結果產生了高分子量的DNA膠狀物。建議將*鏈結果至少稀釋100倍再進行二次擴增。

　　*另外，在二次進口PCR儀時使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可以將退火溫度適當增高或進行熱啟動以提高特異性。

　　8. SSⅢ與SSⅡ有何不同？

　　*具有更高的熱穩定性（達50℃）

　　*具有更長的半衰期（達220分鐘）

　　*對進口PCR儀無抑制

　　*干冰運輸

　　*Tdt活性更低

　　9. 為什么有人更喜歡用SSⅢ而不是ThermoScript？

　　ThermoScript如果保存不當會引起活性很快降低，SSⅢ則更穩定。

　　10. 為什么使用基因特異性引物（GSP）？

　　GSP在擴增低豐度的轉錄本時是最好的。OligodT引物建議用于高質量RNA及全長轉錄本的逆轉錄；隨機引物用于mRNA片段的逆轉錄。

　　11. 進口PCR儀什么情況下需要使用RNase H？

　　在*輪進口PCR儀中RNA/DNA雜合體不能正常變性時