選擇重組蛋白表達的合適方法

實驗步驟

一、引言

選 擇 合 適 醜 組 蛋 白 表 達 方 法 對 于 能 否 及 時 獲 取 所 需 數 量 和 質 量 的 重z組蛋白非常關鍵。選 擇 了 錯 誤 的表達宿主可 能 導 致 蛋 白 質錯 誤 折 疊 或 低 量 表 達 . 缺 少 必要的翻譯后 修 飾或不適當的修飾 。選 擇 表 達 系 統時 需 騎 慮 的 因 素包括蛋 白 質 的 大 小 、二 硫 鍵的 數 目 、所 需 翻 譯 后 修飾的 類型 及 目 標 蛋 自 質 的 定 位 。純 化 后 的 重 組 蛋 自 的 期 應 用 在決 策 過 程 中 也 是 很 關 鍵 的 ，其 應 用 領 域 有 四 大 類 : 結 構 研 究 、體 外 活 性 分 析 、作 為 抗 原 制 備抗 體 和 體 內 研 究 。本 章 的 目 的 是 為 研 究 者 選 擇 合 適 的 表 達 系 統 提 供 指 導 。然 而 ，即 便 憑借這 些 指導 原 則， 很 多 倩 況 下 仍 然 無 法 預 先 確 定 哪 種 表 達 系 統 是 最 合 適 的 ，要 想 找 到 最 理想 的 表 達 系 統 ，必 須 對 多 種 表 達 系 統 進 行 嘗 試 。

目前，學術界和工業界正在使用大量的表達系統。其中的一些表達系統非常新，并未經過足夠的嘗試以評價其實用性。而且，一些已經建立的重組蛋白表達系統 (如轉基因動物），在技術上極具挑戰性，需要消耗大量時間，并且極為昂貴, 因此對于一般實驗室而言并不是可行的選擇。就本章而言，我們只討論大腸桿菌、畢赤酵母、桿狀病毒/昆蟲細胞及哺乳動物的表達系統(對這些表達系統更詳細的介紹見第12?1 5 章 ）。這 4 類表達系統都有簡單易懂的操作方案，小量制備成本低廉，可以很容易從同行或科研產品公司（如Invitrogen、EMI>Novagen、 Stratagene和 P rom ega等）獲得。下面將會對這幾類表達系統的特點和可以進行的選擇進行簡要介紹, 在此重點關注它們之間的不同之處。最后我們會介紹一些策略以幫助研究者選擇最合適的表達系統。

二、大腸桿菌

大 腸 桿 菌 是最早用于重組蛋白表達的宿主菌，其在蛋白質表達領域仍被認為是主要的工具。大腸桿菌較短的增殖時間使其成為一種簡單快捷的重組蛋白表達系統。因此, 評估重組基因在大腸桿菌中的表達只需要不到1 周的時間。培養大腸桿菌的培養基價格低廉，而且已有簡單直接的方法用于生產過程的放大(詳 見 第 12章）。

在 大 腸 桿 菌 中 ，重 組 蛋 白 通 常 定 位 于 胞 質（cytoplasm) 中 ，也 可 以 定 位 于 周 質(periplasm) ，在少數情況下會分泌到胞外。定位于胞質的蛋白質的表達效率是最高的，其產量通常可以占總生物質(biomass) 的 3〇% (Jana and D e b , 2〇〇5)。然而，重組蛋白過高的表達可能會導致不溶性蛋白聚集體的累積，從而形成包涵體Gndusi〇nS b〇dy)。不只是真核生物來源的蛋白質會形成包涵體，少數情況下，包括大腸桿菌在內的過表達原核生物來源的蛋白質也會形成包涵體。在大腸桿菌中，蛋白質翻譯和折疊的速率比在真核細胞中幾乎高1〇倍，這可能是真核蛋白質形成包涵體的原因（Andersson et al.，1982;Goustin and W ilt，1982)。在某些情況下，包涵體大大妨礙了獲得可溶的活性蛋白質。

不過，有時包涵體也能帶來好處，其不易被蛋白酶降解，易于離心濃縮，很少被其他蛋白質污染，而且通過努力，也能將其再折疊成有活性的可溶性蛋白質(詳 見 第 1 7 章）。

1.大腸桿菌： 溫度和分子伴侶

已經有一些技術用于在胞質中盡可能多地形成可溶的正確折疊的蛋白質，而盡可能少地形成包涵體。最容易的方法是在蛋白質表達時降低溫度至15?30°C (Sahdevetal. ，2008)。據推測，降低溫度會降低蛋白質轉錄、翻譯和折疊的速率，從而使蛋白質能夠正確折疊（V e r a e ta L , 2006)。此 外 ，研 究 顯 示 ，低 溫 還 會 降 低 熱 休 克 蛋 白 酶（heatshock protease)的活性 (Spiess e ta L , 1999)。一些研究者通過在胞質中與重組蛋白共表達分子伴侶(molecular chaperone)來促進蛋白質的可溶性 (Young etal. , 2004)。該方法的運用似乎具有蛋白質特異性，因此需要針對每種目標重組蛋白分別進行實驗(Baneyx and Mujacic，2004)。

2. 大腸桿菌： 融合標簽

在重組蛋白的 N 端 或 C 端融合可溶性的融合標簽(fusion tag)是提高許多重組蛋白可溶性的另一種方法(Esposito and Chatterjee, 2006)。已經證明能夠提高重組蛋白可溶性的融合標簽包括谷胱甘肽S轉移酶如glutathione-S-transferase,GST)、硫氧還蛋白（thioredoxin)、麥 芽 糖 結 合 蛋 白（maltose-binding protein，M B P )、小分子泛素樣修飾蛋白(small ubiquitin-modifier,S U M O )及 N u s A 標簽（JV-utilization substrate)。其中 G S T 標簽 和 M B P 標簽還有另外的好處, 可以用做親和純化的標簽。然而令人遺憾的是沒有哪一種標簽能夠適用于所有的重組蛋白，必須對多種融合標簽的促可溶表達能力進行評估。有多種策略可用于移除重組蛋白的融合標簽，廣泛的做法是在融合標簽和重組蛋白之間插入蛋白酶酶切位點，然后使用特異性的蛋白酶將其切除。有時候，移除標簽后重組蛋白可能會變得不可溶，所以必須對這一方法進行謹慎的測試。

3.大腸桿菌： 二硫鍵的形成

對于胞質表達，大腸桿菌通常不能促使重組蛋白二硫鍵(disulfide bond)的正確形成；由于二硫鍵氧化還原酶系統(Dsb system)催化作用的存在, 周質通常是大腸桿菌中唯一可形成二硫鍵的場所(Andersen e t a l.， 1997; Bardwell, 1994) 。 因此，如果重組蛋白需要形成二硫鍵，就需要利用一個可切割的信號肽（如 pelB)將其定位于周質。然而 ，周質表達的一個主要不利之處在于蛋白質的表達量會大大降低。硫氧還蛋白（thioredoxin) 和谷氧還蛋白（glutaredoxin) 能夠促進胞質內半腕氣酸的還原反應，通過對大腸桿菌基因組的改造以破壞D sb系統的硫氧還蛋白還原酶基因（thioredoxin reductase gene「 trrB )和谷胱甘肽還原酶基（glutathione reductase gene,g o r), 就可以在胞質內創造更加適于二硫鍵形成的環境(Bessette e ta l.，1999)。這些基因工程改造的菌株已由EMI>Novagen(Origami)公司實現了商業化。如果需要形成更多的二硫鍵，可以將重組蛋白與硫氧還蛋白融合后在trxB-/gor””大腸桿菌菌株中進行表(LaVallie et aL ， 1993) 。

4. 大 腸 桿 菌 ： 翻譯后修飾

最 后 ，必 須 認 識 到 相 比 于 真 核 生 物 ，大 腸 桿 菌 對 蛋 白 質 進 行 翻 譯 后 修 飾 (posttranslational modification) 的 能 力 有 限 。例 如 ，大 腸 桿 菌 不 支 持 酶 介 導 的 N -連 接 的 糖 基 化 (iVlinked glycosylation)、0 連 接 的 糖 基 化（O l i n k e d glycosylation) 、酰 胺 化（amidation) 、輕基 化 (hydroxylation) 、豆 蘧 醜 化（myristoylation) 、棕 櫚 酰 化 (palmitoylation) 和 硫 酸 化(sulfation)

三、畢赤酵母

酵 母 作 為 另 一 種 表 達 重 組 蛋 白 的 強 有 力 的 傳 統 工 具 ，已 被 成 功 應 用 于 大 量 蛋 白 質 的表 達 。酵 母 既 具 有 大 腸 桿 菌 的 許 多 優 點 ，如 增 殖 時 間 短 、基 因 組 易 于 操 作 ，又 具 有 真 核 生物 的 優 勢 ，包 括 改 善 的 蛋 白 質 折 疊 的 能 力 和 大 部 分 的 翻 譯 后 修 飾 能 力 。第 一 個 常 規 應 用于 重 組 蛋 白 表 達 的 酵 母 菌 株 是 釀 酒 酵 母（SaccAarow^yces ceretw』 siae) (Strausberg andStrausberg, 2001)。然 而 ，近 1 5 年 來 ，畢 赤 酵 母 (Pz’ c/iia和u ‘ f o r k ) 已 經 成 為 酵 母 的 首選 , 因 為 該 菌 株 重 組 蛋 白 的 表 達 水 平 高 于 釀 酒 酵 母 (詳 見 第 1 3 章）。畢 赤 酵 母 是 甲 醇 營 養型 酵 母 (methyltropic yeast), 可 利 用 甲 醇 作 為 其 唯 一 的 碳 源（Cregg et al. , 1985)。畢 赤酵 母 在 含 甲 醇 的 培 養 基 中 生 長 ，會 導 致 其 醇 氧 化 酶 (alcohol oxidase，A 0 X )和 二 羥 丙 酮 合酶 (dihydroxyacetone synthase)基 因 發 生 強 烈 的 誘 導 轉 錄（C r e g g ，2007)。經 過 誘 導 ，這些 蛋 白 質 可 以 占 到 畢 赤 酵 母 總 生 物 質 的 3 0 % 。研 究 人 員 將 醇 氧 化 酶 I (A O X l ) 的 嚴 密調 控 的 強 啟 動 子 整 合 入 大 部 分 重 組 蛋 白 表 達 質 粒 用 來 驅 動 重 組 蛋 白 的 表 達 ，已 經 實 現 了對 該 甲 醇 依 賴 基 因 誘 導 作 用 的 利 用（Daly and H e a m , 2005)。畢 赤 酵 母 的 表 達 載 體 會 整合 到 基 因 組 中 ，而 釀 酒 酵 母 的 表 達 載 體 是 游 離 復 制 (replicating episomally)的 質 粒 型 表 達載 體 ，這 種 載 體 很 不 穩 定 。利 用 畢 赤 酵 母 評 估 重 組 基 因 的 表 達 需 要 3? 4 周 ，這 包 括 酵 母的 轉 化 、篩 選 陽 性 整 合 的 轉 化 子 和 蛋 白 質 的 表 達 所 需 的 時 間 。畢 赤 酵 母 一 個 能 打 動 人 的優 點 是 其 在 合 適 的 培 養 條 件 下 能 夠 獲 得 極 高 的 細 胞 密 度 (C r e g g , 2007)。只 需 使 用 成 本低 廉 的 培 養 基 ，畢 赤 酵 母 就 能 達 到 120 g /L 的 細 胞 干 重 密 度 。需 要 重 點 注 意 的 一 點 是 ，誘導 用 培 養 基 中 需 要 含 有 低 百 分 比 的 甲 醇 ，在 大 規 模 培 養 中 ，甲 醇 的 量 達 到 了 產 生 火 災 風 險的 程 度 ，需 要 采 取 更 高 一 級 的 安 全 措 施 。

畢 赤 酵 母 已 經 用 于 獲 取 胞 內 和 分 泌 表 達 的 蛋 白 質 。與 其 他 真 核 生 物 一 樣 , 它 可 以 有效 地 形 成 二 硫 鍵 ，而 且 已 經 成 功 用 于 表 達 含 有 多 個 二 硫 鍵 的 蛋 白 質 。為 了 便 于 分 泌 表 達 ,必 須 對 重 組 蛋 白 進 行 改 造 以 使 其 攜 帶 信 號 肽 序 列 。最 常 用 的 信 號 肽 是 釀 酒 酵 母 的 cr交配 因 子 (a-mating factor)的前-原(pre-pro)序 列（Daly and H e a r n , 2005)。 由 于 畢 赤 酵 母只 分 泌 很 少 的 內 源 性 蛋 白 ，從 培 養 基 中 純 化 重 組 蛋 白 是 個 相 對 簡 單 的 工 作 。如 果 重 組 蛋白 的 酶 解 比 較 嚴 重 ，可 以 利 用 Pep4 蛋 白 酶 缺 陷 型 畢 赤 酵 母 菌 株 進 行 表 達 (Gleeson et al. ，1998)。該 菌 株 具 有 較 低 的 液 泡 肽 酶 A (vaCU〇 k peptidase A )活 性 ，該 酶 負 責 活 化 羧 肽 酶Y(carboxypeptidase Y )和 蛋 白 酶 B K p r o t e a s e B I ) 。

酵母具有翻譯后在特異的天冬酰胺殘基(N-連接)和絲氨酸/蘇氨酸殘基(〇■連接)添加聚糖 (glycan)的能力。這些聚糖的結構與昆蟲和哺乳動物細胞修飾添加的聚糖的結構是很不相同的。在畢赤酵母中，N-連接的聚糖是高甘露糖(mannose)型 的 ，通 常 有 8?17個甘露糖，而釀酒酵母聚糖含有50?150個甘露糖殘基(Celik et al. ， 2007; Gemmill andTrimble, 1999)。與昆蟲和哺乳動物細胞相似的是，在 酵 母 中 N-連接聚糖的一致序列是Asn-Xaa-Ser/Thr。有兩個研究小組已經通過全面的工程改造獲得了兩個畢赤酵母的菌株 ，它們能夠產生可以與哺乳動物細胞中相媲美的復雜的 N-連 接 聚 糖 結 構（Hamiltonand Gerngross, 2〇 07)。然而, 其他研究人員只能使用Roland Contreras研究小組開發的菌株，而且必須得到Research Corporation Technologies的許可。對 畢 赤 酵 母 中O■連接聚糖的結構研究還不很充分，但已知其是通過在絲氨酸/蘇氨酸殘基上添加1?4 個甘露糖殘基形成的（Goto, 2007; Trimble et al.， 20 〇 4)。已有數個報道指出，某些特定蛋白質在畢赤酵母中表達時會被添加O 連接聚糖，而在哺乳動物細胞中的內源性表達卻不會這樣（Daly and Hearn， 2005)。

四、桿狀病毒/昆蟲細胞

在昆蟲細胞中由桿狀病毒(baculovirus)介 導的蛋白質表達為重組蛋白制備提供了另外一種手段(詳 見 第 14章）。桿狀病毒是一種裂解性的（lytic) 、大的（130 k b )雙 鏈 D N A病毒 ，其中桃木菌屬(Awi呀 病 毒 是 最 常 用 于 重 組 蛋 白 表 達 的 桿 狀 病毒 。桿狀病毒通常在來源于秋天彳了軍蟲草地貪夜蛾（fall a r m y w o r m Spodoptera frugiperda )(Sf 9 、Sf 2 1 ) 的昆蟲細胞系中進行增殖, 而重組蛋白的表達既可在上述細胞系中完成，也可在來源 于擬尺罐粉紋 夜 蛾（cabbage looper Tii) 的 細 胞（H i g hFive)中進行(Kost etal. ， 2〇〇5)。起初，構建重組桿狀病毒的工作涉及將具有桿狀病毒

D N A 側翼序列的目標 基 因 與桿狀病毒的D N A 共轉染昆蟲細胞(insect cell) , 然后篩選出稀 有 的 同源重組體。重組體的鑒定是通過篩選形態改變的空斑(plaque)來 實現的，而且通常需要另外的多輪空斑篩選以確保制備的重組病毒中未污染有野生型病毒。這種耗時耗 力 的重組病毒制備方法在大多數時候已經被位點特異性轉座技術(Bac^to-Bac或 Ba c uIoDirect, Invitrogen) 和改 良 的 同源重組 技 術 (該 技 術 使 用 在 orfi62 9 含有一個致死突變的工程桿狀病毒）（來自 Oxford Expression Technologies 的 flashBAC, 或來自 E M D ——N o -v a g e n 的 B a c M a g i c ) 所取代。因為其重組效率為 100%, 這兩種方法都省略了分離空斑的操作。1 輪 或 2 輪的重組病毒擴增后，研究人員可以使用空斑分析法、更新穎更快速的實時定量 PC R法或基于抗體的分析法對桿狀病毒的濃縮液進行定量（Hitchm a n et al. ，2007; K w o n et a l .， 2〇 02)。重組桿狀病毒構建和定量方法上的進步已經極大地減少了使用桿狀病毒進行表達的時間—- 縮短至大約3 周 ，這其中包含為了優化表達而耗費的時間。

桿狀病毒表達系統中最常用的是polH 啟 動 子 和 plO啟 動 子 ，二者均能在桿狀病毒感染的晚期經誘導產生高水平的表(Ikonomou e t a l . ， 2003)。在此階段, 細胞開始死亡 ，并伴隨著蛋白酶的釋放，這些蛋白酶可能會導致重組蛋白降解。為了減少重組蛋白的酶解，已經使用了在細胞裂解周期中較早階段激活的啟動子，如基本啟動子（basic prom oter) (Ikonomou et al. ， 2003) 。 CA￡A 和1)——〇1執基因分別編碼幾丁質酶（chitinase) 及一種組織蛋白酶(cathepsin protease)，也可以通過構建二者的基因缺陷型以盡量降低蛋白質水解的作用（Monsma and Scott, 1997)。

桿狀病毒介導的蛋白質表達通常既能用于制備胞質表達的重組蛋白，又能用于獲取分泌表達的重組蛋白。高效的分泌表達一般需要信號肽的參與。昆蟲和哺乳動物的信號序列都能引導重組蛋白進入昆蟲細胞的分泌途徑。起初 ，昆蟲細胞的培養是在含血清的培養基中進行，這使分泌蛋白的純化變得復雜。近來新研發的培養基允許使用動物組織或植物組織的蛋白質水解液代替血清，從而大大簡化了蛋白質的純化 (Ikonomou et al. ，2003)。不過 ，這種特殊的培養基造價高昂，限制了它在大規模生產中的應用。

昆蟲細胞能有效地在重組蛋白中形成二硫鍵，也能進行絕大部分發現于哺乳動物細胞的翻譯后修飾。然而，大部分昆蟲細胞中形成的JV-連接聚糖都是巖藻糖苷寡甘露糖(fucosylatedpaucimannose)結 構（Man3 GlcNAc2-N-A sn) (H arrison and Jarvis, 200 6;Jenkins e ta l. ，1 9 % ) 。這一發現促使人們于最近構建了能夠產生含有常見于哺乳動物細胞中的復雜N -連接聚糖的糖蛋白的昆蟲細胞系（Harrison and Jarvis, 2006)。一個能夠表達數種糖基轉移酶的轉基因 S f-9 昆 蟲 細 胞 系 已 實 現 了 商 業 化（Mimiccelllin eInvitrogen), 其產生的 N -連接聚糖包含一個雙觸須樣唾液酸化(sialylated)結構。目前僅有幾篇文獻描述了昆蟲細胞產生的O 連接聚糖的結構(Chen et a l . ， 1991; Sugyiama eta l . ， 1993; Thomsen et a l . ， 2004)。

五、哺 乳 動 物 細 胞

以前通常認為哺乳動物表達方法是重組蛋白表達效率最低的方法。然 而 ，最近的研究進展已經極大地提高了哺乳動物細胞系的表達水平(詳 見 第 15章)。例如, 有報道稱利用穩定轉染的中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary,C H O )細胞，重組抗體的表達水平可以達到幾個毫克每升(Figueroa e t a l . ， 2007; W urm, 2004)。 雖然目前已經測試了多種細胞系和表達策略，但本章我們主要關注人胚腎（human embryonic kidney,H E K 293)細胞的瞬時轉染和C H O 細胞的穩定轉染。

H E K 293 細胞系來源于腺病毒轉化的人胚胎腎細胞。利用特定的轉染試劑，如陽離子 脂 質 體（cationic lipids) 、憐 酸 耗（calcium ph o sp h ate)或 聚 乙 烯 亞 胺（polyethyleneim in e)，H E K 2 93細胞能夠實現較高的瞬時轉染效率（> 8 0 % )(D u ro ch er et aL , 2002;Jo rd an etaL , 1996)。 對于大規模的瞬時轉染( > i 〇 0 mL)，相比陽離子脂質體，以磷酸鈣或聚乙嫌亞胺作為轉染試劑是更加經濟高效的選擇 (Baldi et a L ， 2007)。 已經有人進行了生物反應器級別的瞬時轉染，不過對于大多數實驗室來說, 這個規模在技術上還是很有挑戰性的 (G irard etal. , 2002)。瞬時轉染技術相對簡單，而且對于給定的重組蛋白，其評估 可 在 2 周內完成。

當需要大量的重組蛋白時，通常選擇 C H O 細胞作為哺乳動物表達系統。例如 ，當前市場上大部分治療用抗體就是用該細胞系生產的。標準的穩定轉染 C H O 細胞表達技術涉及使用具有二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase,D H FR) 選擇標記表達框和目標基因表達框的載體轉染 D H F R 缺陷型的 CH? 細 胞（W urm ，2004)。二氫葉酸還原酶能將二氫葉酸（dihydrofolate) 還原為四氫葉酸（tetrahydrofolate)，后者對于嘌呤（purine)、特定的氨基酸和脫氧胸苷酸 (thymidylic acid)的從頭合成是必需的。氨甲蝶呤 (methotrexate)能結合并抑制 D H FR，可作為選擇試劑使用 ，只有整合了 DHFR 選擇標記表達框的細胞才能存活。連續提高氨甲蝶呤的濃度能造成 D H F R 基因及與其相連的目的基因的大量擴增。經過至少一輪的氨甲蝶呤篩選后, 利用有限稀釋法將穩定轉染的細胞克隆到多孔板中，就實現了穩定轉染細胞群的亞克隆。通常的情況是，篩選得到的亞克隆中只有小部分能夠以較高的水平表達重組基因，因為大部分克隆中表達框都整合到了轉錄不活躍的異染色質區域。不幸的是，整個選擇和篩選的過程需要至少 2?3 個 月 ，這 是 CHO表達方法最主要的缺點。不過 ，目前基于流式技術和自動化技術的高通量技術已經大大簡化了高表達克隆的快速篩選和選擇 (Browne and Al-Rubeai，2007)。另外一個進展是利用位于重組基因表達框兩側的特異性順式作用 D N A 元件 (e x a c tin g DNA element),它們可以使整合位點的轉錄變得活躍 (Kwaks and O tte，2006)。不幸的是，大部分此類D N A 元件由公司擁有，實驗室使用時必須得到公司的許可。此外，即使有了上述的進展，獲得高表達 C H O 克隆株需要的時間依然沒有太大的變化。

哺乳動物表達系統主要用于制備分泌的重組蛋白，而不是制備胞內表達的蛋白質。已經開發出了針對 C H O 和 HEK293細胞系的無血清培養基, 這使分泌表達的重組蛋白的純化變得簡單。不過, 這種培養基價格不菲，使得大規模的生產非常昂貴。

相較于其他表達系統的宿主，哺乳動物細胞具有最出色的蛋白質折疊和二硫鍵形成能力。哺乳動物細胞生成的N-連接聚糖和 0-連接聚糖的結構變化很大，這不僅取決于蛋白質，也與作為表達宿主的哺乳動物細胞的類型相關（Jenkins et al., 1996)。此外，細胞的培養條件，如營養成分、p H 、溫度、氧氣的水平以及氨濃度都能夠對糖基化產生顯著的影響 (Butler，2006)。 JV-連接糖基化的糖會是寡聚甘露糖(〇 lig 〇 mannose)、雜合聚糖及別的復雜聚糖結構，但所有的結構都會包含— 個 Man3 GlcNac2 核 心（Bhatia and Mukhopadhyay，1998)。寡甘露糖聚糖有 2?6 個附加的甘露糖殘基，這些殘基可被磷酸化或硫酸化。最常見的復雜聚糖結構具有 2?4 個連接于 甘 露 糖 的 Gal ，4-GlcNac2 基團 ，它能夠形成 2 個 、3 個 和 4 個觸須樣的分支結構。分支結構末端為唾液酸，分支上還可連接巖藻糖。雜合聚糖同時具有寡聚甘露糖和復雜聚糖結構的特征^ 可根據其核心結構將O 連接糖基化結構分為 8 類 : 0 乙醜半乳糖胺型糖基化(〇 GalN Ac-type glycosylation)、O-乙酰氨基葡糖型糖基化（O G lcN A otype glycosylation)、O-巖 藻 糖 基 化（Ofucosylation)、O-甘?糖基化（Om annosyiation)、O-葡糖基化（O glucosylation)、憐 酸 糖 基 化(phosphoglycosylation)、O-葡 糖 胺 聚 糖 型 糖 基 化（〇 ——glyc 〇 saminoglycan-type glycosyiation)和膠原型糖基化（collagen-type glycosylation) (Peter-Katalinic，2005)。

六、蛋白質的特性

在選擇表達系統時, 可以很容易地通過文獻調研來確認重組蛋白之前是否已被表達過并對公開出版的表達策略做出評估。借鑒文獻報道時，考慮清楚文獻中重組蛋白的應用目的與你的預期應用是否相似或相容是很重要的。缺少文獻信息時，表達或詳細介紹同源蛋白的報道也是很有用的。在過去的十年，表達的蛋白質的數目有了戲劇性地增加，這在一定程度上歸功于多種基因組序列的測定、高通量表達方法的發展以及大規模的蛋白質結構計劃（protein structure initiative,P S I )。這種趨勢很可能會持續下去，這意味著最終前人的大量數據可以使表達系統的選擇變得更加簡單容易。

1. 蛋白質的特性： 大腸桿菌與密碼子用法

—般來說，在重組蛋白表達宿主的選擇中，對原核來源的蛋白質應當只選擇大腸桿菌進行表達，而不是真核表達系統, 因為通常真核生物的翻譯后修飾能力和改善的折疊能力對原核蛋白來說是不必要的，甚至是不想要的。對于真核蛋白來說情況就不同了，因為有大量的實例表明，真核蛋白能在大腸桿菌中進行成功地表達（Sahdev et al. ， 2008)。當使用原核系統表達真核蛋白時 ，一 個非常重要的考慮是: 像所有生物一樣，大腸桿菌對密碼子的使用有偏性，其 t R N A 豐度反映了這一?偏性（Gustafsson et al. ， 2004; M a r i n ，2008)。表達含有數個大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白時會受對應的 t R N A 豐度的限制而效率不高。 tR N A 短缺會導致翻譯移框、氨基酸錯誤摻入及翻譯提前終止等。這個問題在稀有密碼子集中分布于 N 端時尤其明顯（K a n e , 1995)。不過, 通過合成密碼子優化的 基 因 或 者 使 用 稀 有 密 碼 子 t R N A 豐 度 增 加 的 商 業 化 工 程 菌 株（如 R osetta 菌 株 ，E M D ——N o v a g e n ) 可以避免這個問題。在多數情況下, 如果重組基因是在親緣關系很遠的生物宿主中表達, 密碼子偏性也需要加以矯正。

2. 蛋白質的特性: 胞質蛋白

對于胞質蛋白來說，選擇最佳的表達系統取決于蛋白質的大小和分子內二硫鍵的數目。對于分子質量為10?50 kD a 并含有極少二硫鍵的蛋白質而言，大腸桿菌是實現蛋白質可溶性表達的很好選擇（D y s o n e ta L ， 2004)。 對于更大或具有許多二硫鍵的蛋白質來說 ，如果需要 可 溶 性 表 達 ，那 么 通 常 應 優 先 選 擇 桿 狀 病 毒 或 酵 母 表 達 系 統 。對于10 k D a 以下，有極少甚至沒有二硫鍵的蛋白質，已通過融合可溶性標簽，在大腸桿菌中實現了成功表達（Esposito and Chatterjee, 2006)。 或者, 也可以將這些小蛋白質在畢赤酵母中進行分泌表達(Daly and H earn, 2005)。 然 而 ，在這一途徑中, 必須小心監測 ，因為正常情況下存在于胞內的蛋白質被強制進入分泌途徑時可能出現無意產生的糖基化。這可以通過檢查序列確認其不含一致的N-連接糖基化位點來實現。遺憾的是，對 于 〇-連接糖基化，沒有保守序列，所 以必須對分泌的重組蛋白進行分析以確保其不含〇-連接聚糖。

3. 蛋白質的特性： 分泌蛋白

所有的表達宿主都可用于生產分泌蛋白。不過，正如之前所述，大腸桿菌缺少大部分發現于真核生物中的翻譯后修飾功能。因此，大腸桿菌可能不適于表達分泌的真核蛋白，不過這也在很大程度上取決于下游的應用。

4. 蛋白質的特性: 膜蛋白

對于蛋白質的大量表達來說，膜蛋白極具挑戰性。在某些情況下，只表達可溶的、親水的部分就足夠了，此時可以移除跨膜結構域，表達可溶部分。對于完整膜蛋白的表達，如何選擇最佳的表達系統還沒有明確的指導原則 (Sarramegna et al. ，2003)。不過 ，對于大部分真核膜蛋白，由于在折疊和翻譯后修飾能力上的限制，大腸桿菌表達系統通常不是一個很好的選擇。相對的，研究者已報道利用桿狀病毒和酵母表達系統在一定程度上成功地實現了 G 蛋白偶聯受體的表達。

5. 蛋白質的特性: 毒性蛋白

對表達宿主有毒的重組蛋白會給表達帶來挑戰, 不過這通常是可以克服的。如果重組蛋白有毒性，確定其毒性是否具有宿主細胞特異性通常是有用的。如果是的話，那么可以選擇在一個相容性更好的表達宿主中進行表達。另一個選擇是使用嚴格調控的、可誘導的表達系統，如在大腸桿菌和畢赤酵母中應用的那些表達系統。例如 ，已經開發了數個精確調控的可誘導大腸桿菌表達系統(Saida, 2007)。在這些系統中，重組基因的表達由可誘導啟動子、轉錄終止子、質粒拷貝數的控制或重組基因編碼序列的修飾來調控。在可用的畢赤酵母系統中，A O X l 啟動子受誘導機制以及阻遏/去阻遏方法的聯合嚴格調控(Daly and H eam , 2005)。 另外，有數項研究表明桿狀病毒/昆蟲表達系統可用于表達毒性蛋白（Aguiar et al., 2:006; Korth and Levings，1993)。 最后 ，對于哺乳動物表達系統來說 ，最簡單的選擇是瞬轉表達。 C H O 細胞中的數種可誘導表達系統都需要花費相當多的時間以完成必要的細胞工程改造，而且利用這些表達系統很難獲得嚴格調控的基因表達 ，而這種嚴格調控對于防止細胞死亡來說是必需的 (Rossi and Blau, 1998)。

七.重組蛋白的應用

用于結構研究時，重組蛋白的表達要求正確的蛋白質折疊、形成正確的二硫鍵、均一的重組產物。前面已經介紹了每種表達系統的蛋白質折疊和二硫鍵形成的內在能力。不均一性的潛在來源包括鱗酸化、甲硫氣酸氣膚酶(methionineaminopeptidase) 對起始甲硫氨酸的低效切割以及糖基化。不幸的是, 不均一的磷酸化常見于重組蛋白激酶的表達,并且每一種表達宿主都有類似報道。在這種情況下, 可以通過磷酸酶處理去除重組蛋白上的磷酸基團以獲得均一性。當重組蛋白在胞內表達時，可能會出現 N 端甲硫氨酸的不均一性。原核生物和真核生物都含有甲硫氨酸氨肽酶，甲硫氨酸的切割效率受起始甲硫氨酸相鄰的氨基酸的影響 (Giglione etal., 2004)。 通 常 ，該相鄰氨基酸側鏈的大小與甲硫氨酸切割的效率負相關。然而，在大腸桿菌中，高水平表達的重組蛋白會使酶達到飽和 ，并改變有效切割的相關規則 (Dong etal.，1996)。 這種不均一性可以通過小心選擇起始甲硫氨酸的相鄰氨基酸或利用 N 端的可切割的標簽來避免。糖基化的不均一性可見于糖蛋白在所有真核生物中的表達。不過在昆蟲或酵母宿主中這種不均一性通常會低一些 (Jenkins etal. ，1996)。 無論采用何種表達宿主, 通常會在試圖對重組蛋白進行結晶前除去糖基團。

正常情況下，若制備的重組蛋白用做免疫用抗原時，任何表達宿主都是可用的。對于糖蛋白來說，有 時 還 不 清 楚 聚 糖 的 存 在 是 否 會 改 變 重 組 抗 原 的 免 疫 原 性（Bhatia andMukhopadhyay, 1998； Prasad et al., 1995)

適用于體外活性研究及體內實驗的重組蛋白的制備要求蛋白質正確折疊和二硫鍵正確形成。對于糖蛋白來說，N -連接聚糖的存在以及聚糖基團的結構對這兩類應用都有重要的影響，因此在選擇真核表達宿主時必須加以考慮。研究 表 明 ，JV-連接聚糖對蛋白質的結構有積極的影響并增加了蛋白質的穩定性 (Bhatia and M u k h o p a d h y a y , 1998)。在體外 ，已有研究顯示, 某些蛋白質配基上的N -連接聚糖的結構會影響其與受體結合的親和力及信號轉導。在重組免疫球蛋白中，F c 區 保 守 的 N -連接聚糖影響了其在體外的效應活性(Presta, 2008)。例如，人 I g G l 的 N -連接聚糖中巖藻糖的存在降低了抗體依賴的細胞毒性活性(Shinkawa etal.， 2003)。在體內，蛋 白 質 上 N -連接聚糖結構極大地影響了其代謝清除和生物分布。例如 ，無唾液酸帽的 N -連接聚糖會被肝受體 (hepatic receptor),清除這類受體包括脫唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein) 受體和甘露糖受體 （Weigeland Yik， 2002)。 O-連接糖基化的重要性還不明確。如果重組蛋白的糖基化修飾作用還不清楚，那么比較安全的策略是選擇與重組基因來源宿主相似的表達宿主。

八.結論

大腸桿菌、畢赤酵母、桿狀病毒/昆蟲細胞及哺乳動物表達系統在表達重組蛋白方面各有其優缺點 (表 11.1)。一個給定的表達系統能否高水平表達蛋白質并獲得高質量的產品, 這在很大程度上取決于該蛋白質。在選擇表達方法時，必須認真地評估重組蛋白的特性及下游的應用。不幸的是，有時候表達方法的選擇并不是顯而易見的，此時必須對數種表達宿主進行評估。

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