遺傳病與腫瘤的基因診斷

從DNA水平上尋找確診遺傳病的指標或探討遺傳病和腫瘤的病因等方面，已取得很大成績，對產前診斷，早期確診和突變基因攜帶者的檢出等都有重要意義。所用的方法大體有以下幾種。

一、分離基因進行結構分析

利用DNA離體轉化，制備探針，制備基因文庫進行篩檢，最后鑒定載體中插入DNA片段的特性等一系列技術，可以設法分離出目的基因或某一特定的DNA順序。然后通過DNA核苷酸順序分析可以弄清楚某些疾病的病因。

比如，人體癌基因的分離和研究癌基因同原癌基因在DNA的結構與功能上的差別，對了解細胞癌變的機制起了很大的作用。分離目的基因或專一DNA順序常用的是制備分子雜交探針，通過Southern印跡雜交或Northern印跡雜交等，了解某些遺傳病基因結構上的差別，從而找到可靠的診斷方法。

比如，患者的基因是否缺失，重排以及是否存在限制性片段長度的多肽現象等。

二、DNA限制性片段多態性連鎖分析

DNA限制性片段長度多態性（restricition fragment length polymorphism, RFLPs）連鎖分析法是指由于缺失、重排或堿基置換的結果，使DNA分子中原有的某種限制性內切酶的識別位點發生改變，或是消失或是增加，所以酶切后生成的DNA片段的長度也隨之改變。這種DNA限制性片段長度的變化往往同某種疾病的連鎖關系，因而可作為這種疾病的診斷指標。

如果所分析的DNA分子不太大，比如人體線粒體DNA，長16569bp。在這種DNA分子上每種限制酶的識別點不過幾到幾十個，因此，當某種限制酶的識別點發生改變并經過這種酶切后，可清楚地看到DNA電泳帶的圖型發生改變，條帶或者增加或是減少，條帶所處的位置也有變化。

可是，遺傳病病例分析時所用的是基因組DNA，而基因組DNA從限制酶酶切后至少會生成100萬個片段，多的可達1000萬個片段。

如果其中有一、二個片段發生改變，不可能從電泳凝膠上直接觀察分辨。此時就必定要用合適的探針。某個目的基因或某一特定的DNA片段，在同酶切后的DNA作分子雜交后，可在曝光的X線片上看到RFLP。下圖是用分子雜交法檢測RELP示意圖。

這是通過限制酶A識別點的改變出現DNA的RFLP，再以合適的DNA片段作為分子雜交的探針，在探針上標記了放射性同位素，同分別經酶A，酶B完全酶切的DNA作印跡雜交。在曝光后的X線片上可看到不同的雜交帶圖型。

①是正常個體，經酶A和酶B切后的DNA同探針雜交，都只看到一條帶。

②是一個雜合子即隱性突變基因攜帶者的雜交圖式，由于它的一條染色體的DNA分子中酶A的識別點發生改變，酶切后的DNA片段較原來的長，所以出現一長一短兩個片段。

③是突變基因純合子，也就是患者，酶A和B的酶切片段雖然是各有一個，但A的片段比正常的個體長，所以雜交帶出現的位置也有改變。

1974年首次用RFLP作為遺傳學分析的方法。1978年簡悅威和Dozy等第一次用人體β珠蛋白基因作為探針，同限制酶Hpa Ⅰ酶切的DNA做雜交，發現了DNA的RFLP與鐮形細胞貧血之間的關系。

由此可以看出，HpaⅠβ珠蛋白基因13.0kb片段可作為檢出鐮形細胞貧血及攜帶者的一種指標。1981年Geever等根據鐮形細胞貧血是β珠蛋白第6個密碼子的一個核苷酸置換的結果，用限制酶DdeⅠ酶切DNA后與β珠蛋白基因雜交。結果是：Hb基因型AA的正常個體有175bp和201bp二條帶。

SS個體即患者只有一條帶，是正常人兩個DNA片段長度之和，即376bp。AS雜合子則有三條帶：175bp、201bp、376bp。其原因是第6個密碼子中的A被T置換，使Hb A變成了HbS。限制酶DdeI的識別順序為C↓TNAG，當A變成T后，該部位DNA順序變成CTNTG，從而丟失了一個DdeI識別位點，所以HbA的2個DdeI片段（175bp、201bp）變成了HbS的一個DdeI片段（175+201=376bp）。

除了用基因作探針直接檢測基因內的核苷酸變化引起的RFLP外，還有兩種途徑：一是用基因作探針，檢測該基因兩側順序中核苷酸變化引起的RFLP，確定這些RFLP與遺傳病之間有無連鎖關系。另一種是用克隆的專一DNA順序作探針，檢測基因兩側順序DNA的RFLP與遺傳病的連鎖關系。迄今用上述三種方法已查明近30種遺傳病可通過RFLP來檢測。下面列表為部位舉例。

除了遺傳病與RFLP之間的關系的資料，還發現人體癌基因Ha-ras的Bam HI片段的長度可在6.75～8.7kb之間變動。種RFLP是由于Ha –ras基因有一段可變串聯重復順序（vari-able tandem replication,VTR）。

重復順序長28bp、重復次數可以不同，所以造成BamHⅠ片段的長度變化。圖23-9中左圖箭頭是某種酶的切點，黑框代表可變串聯重復順序。

右圖代表某種酶切割后，不同體顯示的電泳圖譜。1/1、2/2、3/3代表1、2、3等位基因的純合子；1/2、1/2、2/3代表三種可能的雜合子，由于重復順序數目不同改變了該酶的切點位置，因而形成不同長度的DNA片段。除Ha-ras癌基因外，成人多囊腎（adult polycystic kidney）基因旁也出現VTR，現已用它作攜帶者及產前診斷。

三、聚合酶鏈反應

1988年Higuchi等報道，可以從人的單根毛發的毛囊細胞中抽提DNA，并結合運用DNA聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）技術，分析了單根毛發細胞中抽提的線粒體DNA的D環區（D-loop region）的“DNA”指紋圖”。

PCR技術由Mullis等首創。它又稱為DNA體外擴增技術，是用DNA聚合酶在體外擴增一段DNA順序達百萬倍以上。這樣就可直接觀察而不用印跡雜交法。

這項技術的基本原理是，將有待擴增的DNA分子加熱變性成為單鏈，然后加入按欲擴增DNA片段兩端核苷酸順序合成的一對引物和耐高溫的DNA聚合酶，這樣就可以單鏈DNA分子為模板合成了它的互補鏈。接著再加熱使DNA雙鏈解鏈。

由于這類DNA聚合酶是耐高溫的，所以在熱變性處理后仍保持酶活性，在有引物分子存在的條件下又繼續合成該DNA片段。如此循環往復20～30多個周期，微量的DNA分子可增加10萬～100萬個拷貝。

這種技術在醫學上有很大的用途。先是Saiki等（1985）將其用于鐮形表細胞性貧血的快速診斷。繼而Chehab等將其用于Barts胎兒水腫綜合征的前診斷（缺失純合型）。我國吳冠蕓、曾溢滔、蔡仕萍、張基增等在不同實驗室將PCR結合寡核苷酸探針法用于已知點突變的β地中海貧血的產前診斷，并不斷簡化技術。

PCR技術已用于許多疾病的診斷及產前診斷（如血友病、假肥大性肌營養不良、α1抗胰蛋白酶缺乏癥、艾滋病等）。原則上已知DNA順序的基因及突變性質的遺傳病都可以應用此技術。此外，PCR還可用于直接做DNA順序分析。