酵母菌基因組轉座子的誘變實驗

誘變轉座子基因組文庫質粒DNA

10×TE緩沖液 pH 8.0 無菌 E. coli tets kans (如 DH5c×) 14 cm的LB培養基平板 培養基中加入3 mg mL的四環素和40μg  mL的卡那霉素 LB培養基 丙三醇 無菌NotⅠ 非限制性內切核酸酶及緩沖液 Ura3_酵母菌培養 一步（One~step)緩沖液 10 mg mL的變性的鮭精DNA CM缺失成分培養基平板和無尿嘧啶的培養基

臨床用臺式離心機、45℃水浴或孵育箱、無菌牙簽、3MM無菌濾紙（Whatman)

1)溶液干了之后，從轉座子誘變基因組文庫的個體庫里分配質粒DNA (每個庫約為1μg DNA)。短時間離心每個干的樣品，用pH 8. 0的TE緩沖液以合適的容積重懸每 個庫的DNA (如每個庫10體積)。文庫DNA的每個庫都被單獨誘變；所以分開 處理每個庫的DNA以保證得到獨立插入等位基因。

2)從每個庫中取適當的DNA的量，以標準的轉化步驟轉入對任何四環素 (tets)和卡那霉素（kans)敏感的大腸桿菌菌株內。

3)在加入3 pg/mL的四環素和40μg /mL的卡那霉素的直徑為14 cm的LB培養基平板上挑選轉化株。

4)通過在每個平板表面加6 mL的LB培養液洗脫轉化株克隆并刮取細胞使成為均勻的 懸液。保存一部分懸液；-70℃下于15%的丙三醇里保存。

5)用100 mL含3μg /mL四環素和40μg /mL卡那霉素的LB培養基稀釋1 mL這種洗脫 液，進行培養使細胞密度幾乎達到飽和。在通風的條件下，37℃孵育2?3h。

6)通過標準的小量制備或大量制備來分離質粒DNA。

7)用非限制性內切核酸酶NotⅠ消化來自每個庫的小量（典型的量至少為 1μg)的質粒DNA (在步驟6中獲得）。接下來為了確保mTn誘變的酵母菌DNA 從pHSS6載體上釋放，取一部分反應混合物，用瓊脂糖凝膠電泳法進行分析。剩余的反應混合物于4℃保存以備后用（見步驟10)。在電泳凝膠上可以看到一條清楚的2. 1kb的pHSS6條帶和一條寬的8kb的mTn誘變的酵母菌基因組DNA條帶。

8)取10 mL要用作研究的Um3-酵母菌株培液進行培養，使其處于對數生長期（密度為1O⁷細胞/mL或OD₆₀₀約為1)保持適合的選擇，以備應用。

9)臨床用臺式離心機于室溫下1100 g將細胞離心5 min,用5體積的一步緩沖液洗滌沉淀物一次。

10)在1 mL的一步緩沖液里加入1 mg變性的鮭精DNA并重懸細胞，在裝有0. 1?1μL的從步驟7中得到的用非限制性內切核酸酶I消化的質粒DNA的微型離心管里加入100μL 的重懸液，在渦旋振蕩器上振蕩使其充分混合。

11)45°C孵育混合物30 min。

12)室溫下微型離心機上以最大速度將細胞離心5 s，隨后在400μL的CM (-Ura)缺 失成分培養基中重懸沉淀物。取200μL 重懸液加到CM (-Ura)缺失成分培養基平板上。30℃孵育3?4天。

13)為了最大限度檢測出在低水平表達的hcZ-融合產物，將轉化克隆以每平板達到100個克隆的密度用無菌牙簽轉移到YPAD培養基平板上。

14)在CM(-Ura)缺失成分培養基平板上放置一個3 MM無菌濾紙圓片；在許多要用 的培養基平板上重復此操作。將轉化態細胞復制到濾紙覆蓋的平板上，以易于鑒定 YPAD培養基平板上相應的克隆（步驟13)，30℃孵育過夜。

其他生長條件（如在孢子形成培養基上生長）可以根據需要取代上述條件。

15)過夜生長后，從平板上拿起濾紙并放在一個9 cm的玻璃皿的蓋子里。把這個蓋子 放進盛有氯仿的一個15 cm的閉合的玻璃皿里。孵育10?30 min溶解菌株。

16)將濾紙克隆面向上放在很薄的λ-gal培養基平板上，30℃轉化孵育2天。

17)從步驟13得到的再生的YPAD培養基平板上找出產生λ-gal的克隆株（在λ-gal培 養基平板上表現為藍染）。在以后的菌株生長和處理中保持適當的選擇。

其他所需：

YPAD培養基平板：加入80 mg/L腺嘌呤的YPD培養基平板，氯仿，λ-gal培養基平板