酵母DNA的小量制備

酶解酶 100T 酵母細胞

異丙醇 醋酸鉀 SDS 醋酸鈉 山梨糖醇緩沖液 TE 酵母重懸浮緩沖液

YFD 培養基 Sorvall SS-34 轉頭或同類產品 水浴

一、材料

1. 緩沖液和溶液

異丙醇

醋酸鉀（5 mol/L )

SDS (10%, m/V)

醋酸鈉（3 mol/L，pH 7.0)

山梨糖醇緩沖液

TE ( pH 7.4)

含 20 μg/ml RNase 的 TE ( pH 8.0 )

酵母重懸浮緩沖液

2. 酶及其緩沖液

酶解酶 100T

3. 培養基

YFD 培養基

4. 離心機及其轉頭

Sorvall SS-34 轉頭或同類產品

5. 專用設備

預置至 65℃ 的水浴

6. 載體及酵母細胞株

酵母細胞

二、方法

細胞培養及其 DNA 的抽提

1. 用 10 ml YPD 培養基培養酵母。將酵母培養物在 30℃、中度振蕩條件下培養過夜。

2. 取 5 ml 培養細胞置于離心管中。2000 g ( Sorvall SS-34 轉頭，4100 r/min）離心 5 min, 收集細胞。將剩下培養物置于 4℃ 儲存。

3. 用 0.5 ml 山梨糖醇緩沖液重新懸浮細胞。將細胞懸液轉移到一只微量離心管中。

4. 加入 20 μl 酶解酶 100T 的溶液（用山梨糖醇緩沖液配成 2.5 mg/ml 濃度)。將細胞懸液在 37℃ 下溫育 1 h。

5. 用微量離心機離心 1 min, 收集細胞，吸棄上清液。

6. 用 0.5 ml 酵母重懸緩沖液重新懸浮細胞。

7. 加入 50 μl 10% 的 SDS。蓋上管蓋，將離心管快速地翻轉數次，混勻后將離心管在 65℃ 下溫育 30 min。

8. 加入 0.2 ml 5 mol/L 的醋酸鉀溶液，冰浴 1 h。

DNA 的分離

9. 在微量離心機中以最大轉速 4℃ 離心 5 min, 使細胞碎片沉積下來。

10. 室溫下用粗孔吸頭吸取離心上清，轉移到一個新的微量離心管中。

11. 加入等體積室溫下的異丙醇，沉淀核酸。將管內容物混勻，室溫下放置 5 min。

12. 在微量離心機中以最大轉速離心 10 s 回收核酸沉淀。吸去離心上清液，將沉淀在空氣中干燥 10 min。

13. 用 300 μl 含 20 μg/ml 胰 RNase 的 TE ( pH 8.0 ) 溶解沉淀。將消化混合物在 37℃ 溫育 30 min。

14. 加入 30 μl 3 mol/L 的醋酸鈉（pH 7.0）。混勻后，加入 0.2 ml 的異丙醇。再次進行混勻。在微量離心機中以最大轉速離心 20 s, 使 DNA 沉淀。

15. 吸去上清液，沉淀在空氣中干燥 10 min, 用 150 μl TE ( pH 7.0）溶解 DNA。