重疊PCR—overlapPCR

1、簡介 
重疊PCR也是基本的PCR原理：變性-退火-延伸。不同的是在重疊PCR過程是兩個或者幾個片段重疊延伸之后，再進行指數擴增的PCR過程。  
2、基本原理

*步：PCR產生兩個或者幾個片段，這幾個片段之間必須有重疊區。 
第二步：以兩個片段為例，見上圖，*步產生的兩個片段，A D鏈之間有互補，B C鏈之間也有互補，但只有A D鏈互補重疊延伸產生所需要的重疊片段。 
第三步：第二步產生的重疊產物，在上下游引物的存在下，即可進行PCR擴增過程。 請仔細看清楚原理，特別是第二步。  

3.實際操作注意點 

a.*步PCR之后的產物，可以純化，也可以吸取幾μL作為重疊PCR的模板。 

b.第二步和第三步一起稱為重疊PCR，實際發生過程分為兩個步驟。 

c.Taq酶會在末端加A，高保真酶有3’— 5’的外切活性，基于重疊PCR原理和酶的性質，*步和重疊PCR步驟至少有一步使用高保真酶（或者如Taq Plus、EsTaq之類的，有3’— 5’的外切活性），如果*步和重疊PCR都使用普通Taq可能重疊PCR會失敗。

d.基于重疊PCR原理，上圖中第二步A D 鏈直接的退火很關鍵，所以有些protocol會建議重疊PCR分兩個程序進行也是基于以上原理。重疊區的Tm很關鍵，或者說退火溫度很重要。  

4.重疊PCR幾個應用場景 

.片段中間引入突變

b.片段中間引入缺失

C.片段中間引入插入片段

d.片段拼接(如不同結構域DNA pian段拼接) 

e.長片段分段擴增，再重疊PCR拼接

f.從基因組擴增出外顯子，再拼接出完整的CDS區