重大發現：精準基因編輯的機制

　　CRISPR相關蛋白（Cas）和其他靶向核酸酶徹底改變了我們操作基因組的能力，但是在靶向雙鏈斷裂時外源DNA的精確敲入（KI）仍然很困難。成功的KI既需要通過靶向核酸內切酶進行有效切割，又需要募集內源性DNA修復因子，以將所需編輯整合到宿主基因組中。然而，盡管在基因組上有針對性地斷裂的能力已經獲得了許多改進，但是目前對如何利用內源性DNA修復蛋白來促進成功的KI的理解仍然是不完整的。

　　2021年5月26日，麻省理工學院馮國平院士團隊在Cell在線發表題為“Efficient embryonic homozygous gene conversion via RAD51-enhanced interhomolog repair”的研究論文，該研究發現鏈交換蛋白RAD51可通過同源間修復（IHR）機制顯著增加小鼠胚胎中Cas9介導的純合敲除。

　　IHR是減數分裂的標志，但僅在體細胞中以低頻率發生，而其在受精卵中的發生是有爭議的。使用多種方法，該研究提供了可以通過RAD51增強的早期胚胎中內源性IHR機制的證據。可以利用該過程利用外源供體從野生型合子產生純合子，并將雜合等位基因轉化為無外源模板的純合等位基因。總之，該研究發現顯示了IHR在小鼠胚胎中的確鑿證據，并描述了增強基因轉化的有效方法。

　　CRISPR相關蛋白（Cas）和其他靶向核酸酶徹底改變了我們操作基因組的能力，但是在靶向雙鏈斷裂時外源DNA的精確敲入（KI）仍然很困難。成功的KI既需要通過靶向核酸內切酶進行有效切割，又需要募集內源性DNA修復因子，以將所需編輯整合到宿主基因組中。然而，盡管在基因組上有針對性地斷裂的能力已經獲得了許多改進，但是目前對如何利用內源性DNA修復蛋白來促進成功的KI的理解仍然是不完整的。

　　增強KI效率的嘗試主要集中在三種不同的方法上：抑制非同源末端連接，促進末端切除，增強同源性搜索和鏈交換。

　　盡管通過抑制NHEJ促進蛋白53BP1抑制非同源末端連接（NHEJ）的方法取得了令人鼓舞的結果，但其機制及其對同源重組的直接影響還不清楚。促進端部切除的其他方法被認為是邁向同源重組的決定性步驟，但效果不佳，并建議有必要靶向其他分子，加深對末端切除及其后果的了解。

　　鑒于NHEJ抑制的潛在危險以及對末端切除及其促進HR的能力了解不足，直接靶向同源重組機制是增強KI的誘人方法。2016年，一項針對兔胚胎的研究表明，使用RS-1可以顯著增強KI。KI-1是鏈交換因子RAD51的化學激動劑，這是一種對HR至關重要的鏈交換蛋白。在缺乏DNA損傷的細胞中，RAD51會形成小的，無酶活性的七聚體環。響應雙鏈斷裂（DSB），蛋白BCCIP促進BRCA2介導的RAD51自締合的破壞，使RAD51募集至切除的DSB。RAD51隨后在末端切除產生的單鏈突出端上形成長核絲，并積極進行同源搜索和鏈入侵步驟，這些步驟是同源重組的基礎。有針對性的雙鏈斷裂增強了RAD51在HR和KI事件中的核心作用，將RAD51與Cas9融合抑制了HDR。

　　文章模式圖（圖源自Cell）

　　基于上述發現以及RAD51在同源重組中的關鍵作用，該研究試圖進一步探索RAD51在基于Cas9的KI事件中的實用性。出乎意料的是，該研究發現RAD51可以通過增強同源間修復（IHR）來增加純合性。

　　在使用單鏈寡核苷酸供體的KI實驗中顯示出增加的純合性之后，該研究證明了在不使用供體DNA模板的情況下，在不同染色體上多個位點的頻繁純合轉化。然后，該研究確定了可以增強IHR的其他因素，包括能夠實現幾乎無indel IHR的RAD51變異體，并描述了IHR事件的機制特性。總而言之，該研究為小鼠早期胚胎中的IHR提供了確鑿的證據，并表明RAD51和同源重組相關因子可用于增強有效純合KI和無模板等位基因向純合等位基因的無模板轉化過程。