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  • 發布時間:2020-05-19 16:07 原文鏈接: 重組子篩選的原理和實驗方法

      根據載體的遺傳特征篩選重組子,如a-互補、抗生素基因等。現在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區段, 中有β半乳糖苷酶基因(acZ)的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。

      在這個編碼區中插入了一個多克隆位點(MCS),它并不破壞讀框,但可使少數幾個氨基酸插入到β半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能這種載體適用于可編碼β半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此,宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性,但它們同時存在時,可形成具有酶學活性的蛋白質。

      這樣, lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補,稱為a-互補。

      由a-互補而產生的L acZ+細菌在誘導劑PTG的作用下,在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落,因而易于識別。然而,當外源DNA插 入到質粒的多克隆位點后,幾乎不可避免地導致無a-互補能力的氨基端段,使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。

      這種重組子的篩選,又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經連接產物轉化的鈣化菌平板37°C溫箱倒置培養12-16hr后,種組質粒的細菌形成白色菌落。

      重組子的篩選方法常用的有兩種方法:

      1、抗生素篩選法: 菌株為某種抗生缺陷型,而質粒上帶有該抗性基因(如氨芐青霉素,卡拉霉 素等)這樣只有轉化子才能在含該抗生素的培養基上長出。本實驗利用抗生篩選轉化子。

      2、互補法: 現在使用的許多載體(如PUC系列)有含有一個大腸桿菌DNA的短區段,其中含有-半乳糖苷酸基因(lacZ)的調控序列和頭146個氨基酸偏碼區。這個偏碼區中插入一個多克隆位點。受體菌則含編碼β-半乳糖苷酶C端aa的序列。

      當外源基因插入時,=者溶為一體后,郁_半乳糖苷酶表達,在生色底物5 -溴4氯3-~吲哚β-D_半乳糖苷(x-al)培養基中形成蘭色菌落。而當有外源基因插入到多克隆原點,從而造成插入失活,而使lacZ基因不表達而形成白色菌斑。通過顏色不同而區分重組子和非重組子。

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