重組質粒轉化感受態大腸桿菌

實驗概要

              細菌處于容易吸收外源DNA的狀態叫感受態。轉化(Transformation)是指重組質粒導入受體細胞的過程，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段。其原理是細菌處于0℃，CaCl₂低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形。轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經42℃短時間熱擊處理，促進細胞吸收DNA復合物。

主要試劑

        CaCl2（0.1M），LB培養基，瓊脂，氯霉素（Cm）

主要設備

        恒溫水浴鍋，臺式離心機，超凈工作臺，振蕩培養箱

實驗步驟

CaCl₂法制備大腸桿菌感受態細胞，使用DNA片段和質粒載體pYLVS酶切后的連接產物進行轉化：

1.   取一甘油保存的DH5α菌種接種于5mL LB試管中，于恒溫振蕩培養箱上37℃培養16hr以上。同時作Cm陰性對照管。 2.   用移液管無菌條件下取過夜培養液0.2mL，按1%量接種于新鮮的LB中（20mL/100mL三角瓶）。菌液置恒溫振蕩培養箱上37℃培養3hr。 3.   無菌條件下，將上述菌液分裝1mL入1.5mL eppendorf管中。 4.   冰浴10min，5000rpm離心2min。 5.   管口朝下輕甩數次倒干凈上清。加入600?L預冷的100mM CaCl2溶液，混勻后冰浴30min。 6.   5000rpm離心2min，小心倒掉上清CaCl2，留沉淀菌體。 7.   將菌體懸浮于100?L的100 mM CaCl2溶液中，4℃保存。菌體在此步驟后的一周內均可使用。 8.   無菌條件下，取10-20?L連接反應液加入到含100?L大腸桿菌感受態細胞的離心管中，混勻，冰浴30min。 9.   42℃恒溫水浴鍋中保溫90s，過程中勿晃動離心管。立即轉移到冰水浴中。 10. 加入900?L LB培養液，置37℃水浴1hr，每10min翻動一次。 11. 取0.1-0.2mL的連接液轉化菌液直接涂布于含氯霉素（Cm）的LB固體培養基上。同時涂布無Cm的對照。 12. 置37℃生化培養箱15min，待菌液吸收完全后，倒置培養16-20hr。

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