野生型桿狀病毒的純化實驗

桿狀病毒

TE 蛋白酶K N-十二烷基肌氨酸 苯酚 氯仿 異戊醇 乙醇 乙酸鈉

培養瓶 錐形瓶 轉子 離心機 聚苯乙烯管

1.  以每1.8x10⁷細胞的密度接種Sf9細胞于至少10個150 cm² 培養瓶中。27℃溫育約2 h，讓細胞牢固貼壁，以0.1的感染復數用野生型AcMNPV感染。當觀察到多數細胞中含有包涵體時，將病毒上清（約200 ml）轉移至4個50 ml 錐形管中。

2.  4℃ 1 000 g 離心10 min，將病毒上清倒入4個新的管子中。重復離心以去除所有殘留細胞。

3.  將病毒上清置于SW-27超離心管中，平衡后于4℃，100 000 g 離心30 min，收集病毒。傾倒出上清，將管子倒扣于Kimwipe紙巾上，盡可能倒干液體。

4.  仔細檢査病毒沉淀塊，如果病毒沉淀較純（應該是不透明、發白的外觀），則轉至步驟10繼續進行。多數情況下，病毒沉淀塊由于有細胞碎片的存在而會發黃。如果是這種情況，則用下列兩種方法中的一種從細胞殘序物中分離出病毒。

用蔗糖梯度分離純化病毒團塊：

5a.  加入1 ml 0.1xTE緩沖液，反復上下吹打重懸病毒沉淀。如果沉淀難以重懸，則于4℃溫育過夜。

6a.  用溶于0.1 xTE緩沖液中經過濾除菌的超純蔗糖制備兩份從25%到56%蔗糖線性梯度液，置于超離心管中。

7a.  仔細將0.5 ml 病毒懸液鋪至每一蔗糖梯度液的頂部，4℃ 100 000 g 離心90 min。

8a.  用巴斯德吸管將病毒帶轉移至SW-41超離心管中，管的上部加入0.1xTE緩沖液。

9a.  于4℃ 100 000 g 離心30 min，收集病毒，棄上清，倒扣離心管于Kimwipe紙巾上，盡 可能倒干液體。

微量離心純化病毒沉淀塊：

5b.  加入3 ml 抽提緩沖液，反復上下吹打重懸病毒沉淀。如果難以重懸，則于4℃溫育過夜。

6b.  分別轉移1.5 ml 病毒懸液于兩個1.5 ml 微量離心管中。最大速度下微量離心5 min，上清轉移至一個15 ml 聚苯乙烯離心管中。

7b.  用1 ml 抽提緩沖液重懸每一團塊，冼滌。

8b.  在最大速度下微量離心5 min，將兩份上清與15 ml 聚丙烯管中的上清液合并。

9b.  用抽提緩沖液補足至9 ml，分成4.5 ml 的兩小份移至2個15 ml 聚丙烯離心管中。轉至步驟11繼續。

10.  用9 ml 抽提緩沖液重懸沉淀，分成4.5 ml 的兩小份移至2個15 ml 聚丙烯離心管中。

11.  每管分別加入200 ug 10 mg/ml 蛋白酶K，50℃保溫1~2 h。

12.  每管各加入0.5 ml 10%N-十二烷基肌氨酸鈉，50℃溫育2 h或過夜。

13.  用等體積的25：24 ： 1的酚/氯仿/異戊醇抽提DNA兩次。

14.  用一寬嘴（5~10 ml）吸管將含有DNA的水相轉移至另一個15 ml 聚丙烯管中。加10 ml 100%的乙醇，倒轉離心管數次，輕柔混合，于-80℃放置10 min。

15.  于4℃，1 500 g 在臺式離心機中離心20 min，棄上清，以70%乙醇洗滌DNA沉淀，風干30~60 min。加入800 ul 1xTE緩沖液重懸沉淀。 

16.  各取400 ul 移至兩個微量離心管中，每管中加入40 ul 3.0 mol/l 乙酸鈉和2倍體積的100%乙醇重新沉淀DNA放置10 min。

17.  微量離心10 min。棄上清。用70%乙醇洗滌DNA沉淀并凍干，用0.3~1 ml 1xTE緩沖液重懸DNA。測260 nm 吸光值并計算產量。DNA保存于4℃。