量身打造！RNACapseq更適合臨床融合基因檢測

　　基因融合或易位可能產生功能改變的嵌合蛋白，也可能重新排列基因啟動子，通過激活原癌基因或抑制抑癌基因導致細胞信號通路紊亂，它們在腫瘤的發生過程中扮演著重要的角色。[1,3] 例如，BCR–ABL1融合會導致酪氨酸激酶活性以及下游PI3K和MAPK信號通路的組成型激活，使細胞逃避凋亡，實現無限增殖。

圖1. 基因融合致癌機制[1,3]

　　50多年前，BCR-ABL1融合首次在慢性粒細胞白血病中被發現。除血液惡性腫瘤外，技術的進步使得基因融合也在許多實體瘤中得以發現，包括甲狀腺癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌和腎癌等。特別是下一代測序(NGS)的出現，從根本上改變了癌癥基因融合的發掘模式。在目前已報道的近10,000個基因融合中，有90%是通過NGS方法鑒定，包括DNA測序(DNA-seq)和RNA測序(RNA-seq)。通過對TCGA中代表13種腫瘤類型的4300個原發腫瘤樣本的轉錄組數據分析發現，有7%的樣本存在框內激酶融合。更重要的是，可用藥的激酶融合在檢測的單個癌癥類型中檢測到的頻率為1%~9%，包括ALK、ROS1、RET、NTRKs和FGFR（圖2）。

圖2. 融合基因在不同癌癥中的分布[1,4]

　　隨著精準醫療進程的深入，融合基因靶向藥物種類和適應癥正在不斷增加， ALK和ROS1被證明是治療非小細胞肺癌的有效靶點。此外，RET、NTRK1和BRAF重排已在臨床上成功用于靶向治療。例如，針對NTRK融合突變的泛癌種靶藥Vitrakvi（larotrectinib）已獲得FDA批準；由Roche公司開發的“不限癌種”個體化藥物Rozlytrek（entrectinib）也獲得日本厚生勞動省（MHLW）批準，用于治療攜帶NTRK基因融合的晚期復發實體瘤患者。雖然攜帶融合基因靶點的患者比例較低，但由于癌癥人群基數大，可能獲益的患者數量仍然可觀。因此，快速、準確、全面的鑒定融合基因譜可以為患者帶來更優的醫療決策。

表1. FDA批準的融合基因靶向藥（部分）

　　目前，融合基因診斷主要包括熒光原位雜交(FISH)、RT-PCR等方法。雖然這些方法靈敏度高，但通常只檢測單個融合基因的存在，診斷過程漫長、且費用昂貴。此外，這些方法不能識別新的融合基因伴侶或解決復雜的結構重排，這也是導致假陰性結果的主要原因[5]。

　　理想的融合基因臨床檢測應具備以下特點：

　　1）能夠耐受低質量RNA樣本，比如FFPE RNA；

　　2）具有更高的靈敏度，能夠應對低表達的融合基因或正常細胞轉錄本的稀釋；

　　3）可以一次檢測多個基因，且具有發現新融合亞型的能力，因為融合基因伴侶的數量多、融合位點復雜多變（圖3）；

　　4）成本較低，患者能夠承擔，同時節約公共醫療資源；

　　5）具有良好的技術拓展性，根據臨床研究和藥物研發的新進展，可快速更新迭代，適應臨床需求。

圖3. 融合基因亞型較多 [3,4]

　　RNA-seq也分為全轉錄組測序和靶向轉錄組測序。在科研中，盡管全轉錄組RNA-seq（poly（A）和去核糖體）展現出廣泛的潛力，但由于其樣本質量耐受度低、成本高，并不適合用于個體患者的常規臨床檢測。具體而言，poly（A）RNA-seq在對降解的RNA樣本測序時，偏好覆蓋轉錄本3’端，融合位點離3’端越遠便越難檢測。如圖4所示，BCR-ABL融合位點距離ABL1轉錄本3’端5.3Kb，僅當RIN值下降到7時，斷裂位點附近已經沒有Reads覆蓋。當RIN值低于4時，poly（A）RNA-seq對融合基因檢測的靈敏度已經降至50%左右[6]。換言之， RNA-seq poly（A）的融合基因檢測靈敏度嚴重依賴于RNA樣本的完整程度。

圖4. poly（A）RNA-seq對轉錄本覆蓋依賴RNA樣本完整度[5,6]

　　此外，去核糖體RNA-seq（下文簡稱RD-RNA-seq）雖然可以獲得更為完整的轉錄本，但RD-RNA-seq測序成本較高，主要是由于編碼區數據占比較少，rRNA去除效果不穩定，同時還存在原核RNA污染的風險。

圖5. poly（A）RNA-seq和RD-RNA-seq數據分布示意圖

　　與DNA-seq一樣，在RNA-seq中也有兩類靶向測序方法，分別基于PCR和雜交捕獲（下文簡稱RNA-Capseq）。PCR靶向測序有一定的局限性，無法事先明確融合基因和斷裂位點。盡管有報道通過錨定PCR技術進行了優化，但該技術本身的拓展性仍然不如RNA-Capseq [7]。2009年，Levin等人首次利用RNA-Capseq從腫瘤樣本的cDNA文庫中捕獲467個腫瘤相關基因，具有較高的特異性，能夠發現新的嵌合轉錄本，并同時分析轉錄本表達[8]。2011年，Mercer等人證實RNA-Capseq在低豐度轉錄本的分析中具有明顯優勢。2014年，Mercer團隊進一步對RNA-Capseq技術進行了系統升級，RNA起始量降低30倍，從3μg下調為100ng。如圖6所示，在低質量FFPE RNA樣本中，RNA-Capseq對轉錄本的測序深度和覆蓋均一性均明顯優于poly（A）RNA-seq。研究人員很快意識到， RNA-Capseq更加適合臨床樣本的融合基因檢測。

圖6. 基于雜交捕獲的RNA-Capseq可耐受高挑戰樣本[9,10]

　　與WGS適用于NIPT一樣，RNA-Capseq可謂是為融合基因檢測量身打造，具有耐受低質量RNA樣本、高靈敏度、高基因通量以及Panel易于延伸拓展等優勢。如圖7所示，其檢測原理是根據覆蓋融合位點附近的嵌合Reads來預測融合的發生。

圖7. RNA-Capseq檢測融合基因示意圖[11,12]

　　因此，近年來，RNA-Capseq已被建議作為實體瘤和血液腫瘤的融合基因診斷方法 [12,13]。2016年，He等人驗證了RNA-Capseq在血液惡性腫瘤融合基因檢測中的表現。2017年，Reeser工作小組驗證了RNA-Capseq在實體瘤融合基因檢測中的性能，該方法對93個激酶和轉錄因子基因的完整轉錄本進行了檢測。在74個陽性和36個陰性對照樣本中，RNA-Capseq融合檢測的敏感度為93.3%，特異性為100%。將該方法應用于前瞻性患者樣本，發現OLFM4作為新的RET融合伴侶，并在一名前列腺癌患者中發現KLK2-FGFR2融合，該患者隨后接受了泛成纖維細胞生長因子受體抑制劑的治療。除融合檢測外，該方法還可以提供基因表達分析、單核苷酸變異檢測和選擇性剪接識別等多種分析。

圖8. RNA-Capseq應用于臨床融合基因診斷[12,13]

　　經典文獻分享

　　最后，再給大家分享一篇經典的關于RNA-Capseq應用于腫瘤融合基因檢測的文獻。研究小組在細胞系和人工標準品中，對采用實體瘤和血液腫瘤2種Panel的RNA-Capseq方法進行了實驗和信息分析優化。隨后，對該方法進行回顧性驗證（n=72），結果顯示，其融合基因診斷率較傳統方法提高13%。此外，該研究還進一步嘗試采用RNA-Capseq分析免疫組庫，全面呈現了RNA-Capseq改善臨床融合基因檢測的巨大潛力。

圖9. RNA-Capseq應用于血液和實體瘤癌癥的融合基因診斷[11]

　　1. 實驗方法

　　文庫構建和雜交捕獲：細胞系和臨床樣本RNA投入量分別為4μg和100-1000ng，預文庫構建和雜交捕獲分別采用Roche KAPA鏈特異文庫構建試劑盒(#07277261001)和Roche雜交捕獲試劑盒SeqCap EZ Accessory Kit v2 #07 145 594 001； SeqCap EZ Developer Enrichment Kit #06 471 684 001； SeqCap EZ Hybridisation and Wash Kit #05 634 261 001）。

　　探針設計及合成：經驗根據文獻和公開數據庫選擇目標基因，鑒于Roche探針的超多重疊瓦設計、融合基因探針設計算法以及積累多年的探針數據庫等優勢，從Roche合成實體瘤和血液腫瘤Panel探針（探針基因組成如圖9所示）。

　　2. RNA-Capseq數據表現

　　On-target為~ 50%（一次捕獲）和93%（二次捕獲），血液腫瘤Panel的On-target略高于實體瘤Panel（中位數99.3 v 94.7,）。更為重要的是，FFPE與新鮮冷凍組織（FFT）的On-target無顯著差異，表明即使是具有挑戰性的FFPE組織也可以通過RNA-Capseq進行靶向富集。兩種Panel的轉錄本覆蓋均勻性良好。此外，血液腫瘤和實體瘤Panel對已知剪接位點的覆蓋分為77.8和84.6%。以上研究結果表明， RNA-Capseq中的兩種Panel均具有檢測大部分基因易位的能力(圖10)。

圖10. 血液和實體瘤Panel的RNA-Capseq數據表現

　　3. 融合基因檢測

　　在評估了多個融合基因分析工具后，研究人員最終確認STARfusion和Fusioncatcher兩種算法同時檢測到融合基因作為判定條件。RNA-Capseq成功檢測到6個細胞系中所有的已知融合基因。值得注意的是，RNA-Capseq檢測融合基因并不需要同時靶向兩個融合基因伴侶(圖11 d)，表明RNA-Capseq捕獲和識別新的非靶向融合伴侶的能力。更為重要的是， RNA-Capseq在檢測低豐度融合基因時，較標準RNA-seq具有明顯的優勢。例如，在BCR-ABL1融合基因的檢測時（8-24 DNA拷貝-K562），兩種方法沒有明顯差異；當檢測EWSR1  -FLI1融合基因時（單個DNA拷貝-RDES），標準RNA-seq對融合位點已經沒有reads覆蓋，說明靶向富集對于低豐度融合基因檢測具有獨特的優勢(圖11 b)。

圖11. d. 人工合成標準品投入量與融合位點Reads相關性散點圖；b. RNA-Capseq與標準RNA-seq對不同表達量的融合基因的融合位點覆蓋情況。

　　4. 基因表達檢測

　　采用3x3x3（3 Sample；3 Cap；3 Seq Lane）方式評估RNA-Capseq對臨床樣本基因表達檢測的重現性。實驗結果表明，批內和批間重復穩定，平均變異系數分別為0.073和0.071。此外，聚類分析結果也表明基因表達檢測的高重復性。有趣的是，較內源融合伴侶，基因融合后往往出現更高的表達，例如，與未融合的EZR和ROS1基因相比，EZR-ROS1融合基因表達量較高，暗示還存在其他調控方式 (圖12 A)。更為重要的是，即便RNA-Capseq不能直接檢測到融合不同基因上游啟動子的染色體重排，但它仍可能檢測到由此導致的基因表達變化。例如，在一個RNA-Capseq無法確認融合基因的肉瘤患者中，先前的診斷結果為ROS1染色體重排，RNA-Capseq表達量分析顯示，ROS1表達式是其他肉瘤樣本的50倍 (圖12 B)。

圖12. A. EZR-ROS1融合基因的表達量明顯高于未融合的EZR和ROS1基因；B. 啟動子易位導致ROS1高表達量。

　　5. 免疫組庫分析

　　由于一系列血液腫瘤中涉及IG/TCR受體基因座的融合基因，因此該研究也在血液Panel中加入了針對V、J和C外顯子的探針(圖13 a)，并利用血液Panel在患者隊列中確認了3例攜帶IGH-MYC或IGH-BCL6融合基因的淋巴瘤患者。除了融合基因檢測，這些探針還捕獲了免疫受體表達的轉錄本(圖13 a)。接下來，研究人員還評估了血液Panel在細胞系和臨床樣本中解析免疫組庫的能力。在臨床隊列的32例血液病患者樣本(29例癌變和3例健康)中，大多數腫瘤和正常樣本表達了數百種不同的免疫受體克隆型，每個克隆都有少量的reads(圖13 b)。在骨髓樣本中， IG克隆比TCR克隆更多，反映了骨髓中成熟B細胞的多樣性(圖13 b)。值得注意的是，在29個腫瘤樣本中，有2例的T/BCR克隆數遠多于其他樣本（10x/100x），這可能反映了惡性T細胞和b細胞克隆群的存在(圖13 b)。

圖13. a. TCR/BCR 探針設計示意圖 b. 用MiXCR對細胞系和臨床患者樣本中的免疫受體克隆型進行定量

　　總 結

　　產生融合基因的染色體易位是導致癌癥的重要原因，其準確診斷對有效治療至關重要。然而，傳統方法，如FISH和RT-PCR依賴于先驗數據庫，通量和分辨率較低。因此，通常只針對最常見的融合基因，可能需要反復檢測，并極有可能導致治療延誤或誤診。

　　與此前的技術相比，RNA-Capseq能夠在一次檢測中評估數百個基因，提供高分辨率的融合基因檢測，能夠同時識別已知和新的融合基因。雖然NGS檢測流程較長，但這種多基因“寬度”可以縮短診斷時間，同時提高診斷率。鑒于這些優點，RNA-Capseq越來越多地被用于融合基因的診斷。

圖14. 多種融合基因檢測技術路線對比圖

　　然而，盡管RNA-Capseq的高通量特性為癌癥診斷提供了更廣泛的途徑，但事實上，假陽性率較高仍是我們面臨的一個重大挑戰。但我們相信，隨著技術的不斷完善，RNA-Capseq將為患者提供更細致的治療和預后措施，為患者提供更好的護理。

　　參考文獻

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