長讀長測序的“災難”——檢測結構變異成為空談！

　　 長讀長測序技術以其讀長的優勢，能夠更大程度的檢測結構變異（Structural Variations，SV）。然而面對市面上常見的Nanopore測序技術，檢測結構變異的事實真的如此嗎？在今年11月bioRxiv雜志上發表的文章則指出：使用Nanopore對具有反向重復結構的CNV序列進行DNA測序時，出現了非常嚴重的錯誤，甚至于評價這樣的錯誤會造成災難性的后果。

　　該文章的通訊作者是來自紐約大學生物學系基因組和系統生物學中心的David Gresham教授。

　　反向重復是拷貝數變異（CNV）的一種表現形式，其典型特征是具有兩個方向相反的重復區域通過連接點進行連接。反向重復序列常見于許多基因組中。通常認為這一形式的變異在物種基因組的適應性與進化中發揮了重要的作用，并且與人類的一些疾病發生有關。

　　長讀長測序技術以其讀長優勢，通常被認為在讀取CNV區域有著更好的表現。本文的作者也采用了Oxford Nanopore Technology的MinION對酵母（Saccharomyces cerevisiae）進行測序，發現大多數跨越預測的反向重復連接的reads(80-100%)顯示出phred低分，并且這些reads與參考基因組高度不匹配。結合來自illumina測序結果，通過分析，作者發現來自Nanopore測序低質量的數據對應的序列位于NGS數據所示反向重復連接點的附近。

　　作者選擇了不同的base caller軟件，但都無法準確的讀取這一區域的堿基序列。或許對Nanopore技術有一定認識的研究人員明白，事實上Nanopore的堿基讀取依賴于機器學習對應數據與實際信號的相似度。

　　通過進一步的分析，作者認為反向重復序列可能形成的DNA二級結構導致了測序數據的不準確性。當反向重復結構的DNA雙鏈解開，穿過Nanopore的納米小孔后，容易形成單鏈的互補配對。由此，互補的二級機構將對后續檢測的DNA分子形成拉力，從而使得堿基讀取出現了不可彌補的系統性錯誤。而這樣的錯誤也是災難性的！

　　在長讀長測序技術大放異彩的今天，結構變異的檢測也逐漸受到了更多的重視。越來越多的研究采用了長讀長測序技術進行結構變異相關的研究。但測序的準確性依然不可忽視，并非僅僅依靠長讀長，就能夠對結構變異進行精準的檢測。從今天分享給各位的文章中，我們也可以發現，來自Nanopore測序技術的reads所具有系統性錯誤，并不利于全面的發現基因組中的結構變異，亦或是進行更準確的分析。相比之下，PacBio SMRT測序，則不僅能夠獲得長度更長，更為準確的DNA序列信息，用于分析包括結構變異在內的所有變異。還能借助于高達Q30的準確度，進行單倍型、順式/反式突變的準確分析。